ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 5, с. 517-523
= БИОХИМИЯ
УДК 577.155.21213
КОМПЛЕКС РЕПАРАТИВНОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ b С АВТОНОМНОЙ 3'—-5'-ЭКЗОНУКЛЕАЗОЙ ПРОЯВЛЯЕТ ПОВЫШЕННУЮ ТОЧНОСТЬ СИНТЕЗА ДНК
© 2007 г. Н. В. Белякова, Т. П. Кравецкая, О. К. Легина, Н. Л. Ронжина,
И. В. Шевелев, В. М. Крутяков
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Отделение молекулярной и радиационной биофизики, 188300 Гатчина, Ленинградская обл., Орлова роща
E-mail: krut@omrb.pnpi.spb.ru Поступила в редакцию 07.07.2006 г.
Из хроматина гепатоцитов нормальных крыс впервые выделены комплексы репаративной ДНК-полимеразы в с 3'-экзонуклеазой и некоторыми другими белками. Биополимеры экстрагировали из хроматина раствором NaCl и Тритона X-100. Экстракт фракционировали с помощью гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-300 последовательно в растворах с низкой и высокой ионной силой, на оксиапатите и на колонке с сефадексом G-100. Комплексы имеют молекулярные массы 100 и 300 кДа. В процессе их хроматографии на колонке с ДНК-целлюлозой или после гель-фильтрации в присутствии 1 М NaCl наблюдается разделение полимеразной и экзонуклеазной активностей. Со-очистка полимеразы с экзонуклеазой восстанавливается в 0.1 М NaCl. Точность работы мономерной и комплексной ДНК-полимеразы в измеряли, используя ДНК фага фХ174 амбер 3 в качестве праймера-матрицы. Продукты синтеза трансфецировали в сферопласты Escherichia coli и определяли частоту обратных мутаций. Комплексная форма ДНК-полимеразы в с З'-экзонуклеазой работает в 30 раз точнее мономерной формы полимеразы, что может понизить вероятность репаративно-го мутагенеза и канцерогенеза.
Попытка найти in vivo комплекс с корректорской 3'—>-5'-экзонуклеазой (КЭ) является актуальной для исследования всех склонных к ошибкам эукариотических ДНК-полимераз: ß, Z, П, I, к, 1, ^ и концевой трансферазы, лишенных собственной 3'—>-5'-экзонуклеазной активности. Эти полимеразы ошибаются с вероятностью 10-1-10-3 (Крутяков, 2006), что значительно превосходит вероятность ошибки (10-5) главной элонгирующей ДНК-полимеразы 5 и находится в противоречии с низкой частотой спонтанного мутагенеза у эукариот в пересчете на реплициро-ванный нуклеотид: 10-10-10-12 (Wabl et al., 1985; Drake et al., 1998). Следовательно, подавляющее большинство полимеразных ошибок исправляется в клетке. Пострепликативная репарация (mismatch repair) снижает частоту мутагенеза, но лишь на 1-3 порядка величины (Roberts, Kunkel, 1996), что не снимает парадокса "высокая ошибочность ДНК-полимераз, но низкая частота спонтанного мутагенеза". ДНК-полимераза ß является основной полимеразой, заполняющей короткие одно-нитевые пробелы при репарации поврежденной ДНК (Hubscher et al., 2002). Суммарная вероятность ошибок этой полимеразы составляет 10-3: вероятность замены оснований плюс частота сдвига рамки считывания (Kunkel, 1992). Важность увеличения точности полимеразы ß подчеркивается тем, что в клетке человека за сутки образуется 105 спонтанных повреждений ДНК в
результате ее дезаминирования, депуринизации, окисления и неправильного метилирования, и по-лимераза в участвует в их репарации (Hoss et al, 1999). В настоящее время известны две статьи, в которых показано, что в экстракте клеток человека работа неточной ДНК-полимеразы п корректируется экзонуклеазной функцией ДНК-полимераз 5 или £ (Bebenek et al., 2001; McCulloch et al., 2004). Аналогичное исправление полимеразных ошибок могут осуществлять и автономные КЭ (т.е. не связанные ковалентно с ДНК-по-лимеразами), широко распространенные среди различных организмов по всему филогенетическому древу (Крутяков, 2004). Пока отсутствуют данные о комплексах полимеразы в с КЭ в хроматине из клеток других многоклеточных организмов или в этих комплексах не проведена дискриминация между КЭ и ДНК-полимеразами 5 и £, проявляющими свою собственную 3'—«-5'-экзо-нуклеазную активность. Как и другие склонные к ошибкам полимеразы, ДНК-полимераза в способна обходить (bypass) ряд повреждений в ДНК-матрице чаще всего ценой ошибок (Servant et al., 2002).
В настоящей работе впервые выделены комплексы ДНК-полимеразы в с 3'—»5'-экзонукле-азой и некоторыми другими белками из хроматина печени нормальной белой крысы. Присутствие 3'-экзонуклеазы в комплексе существенно повысило
точность работы ДНК-полимеразы р. Подобные комплексы пока не были обнаружены в субклеточных фракциях из клеток других эукариот.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследован водонерастворимый хроматин, выделенный в условиях низкой ионной силы из ядер 60 г печени нормальных белых крыс. Свойства используемых реактивов, работа с животными, получение хроматина и других субклеточных препаратов, штаммы бактерий и бактериофагов, получение ДНК, равномерно меченной радиоактивными нуклеотидами или меченной только по З'-концам, измерение концентраций биополимеров описаны ранее (Belyakova et al., 1993). Электрофорез белков в геле полиакриламида проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970), белковые полосы окрашивали серебрением. Точность синтеза ДНК измеряли по частоте реверсии мутанта амбер 3 бактериофага ÇX174 согласно методу Кункель и др., (1983).
Активность ферментов измеряли в 0.05 M mpuc-HCl буфере, рН 7.0 (3'—-5'-экзонуклеаза) или pH 8.0 (ДНК-полимераза в), содержащем 2 мМ 2-меркаптоэтанол (2-МЭ), 0.1 M NaCl и 5-10 мМ MgCl2, при 37°С. За 1 единицу экзонуклеазной активности принимали количество фермента, превращающего 10% радиоактивности 3'-меченой од-нонитевой ДНК (2 мкг/мл) в кислоторастворимые продукты за 1 ч. За 1 единицу ДНК-полимеразной активности принимали количество фермента, превращающего 1 нмоль общего дНТФ в кислотоне-растворимый продукт за 1 ч (1 мкМ [3H|TTî, 10 мкМ остальные дНТФ, 70 мкг/мл активированной ДНК-матрицы). Активность полимеразы в не подавляется в присутствии N-этилмалеимида (N-ЭМИ), тогда как этот ингибитор необратимо подавляет активность ДНК-полимераз а-семей-ства (Wang, 1991), что используется для идентификации этих полимераз в настоящей работе. Экстракция белков из хроматина гепатоцитов проводилась в 0.05 М mpuc-HCl буфере, pH 8 в присутствии 0.4 М NaCl, 1%-ного Тритона X-100 и 0.1 мМ фенилметилсульфонил фторида (ФМСФ) -ингибитора сериновых протеаз, в течение 30 мин при 4°С. Нуклеопротеидный осадок отбрасывали после 30 мин центрифугирования при 8000 g, надо-садочную жидкость использовали для дальнейшего фракционирования. Соотношение активностей 3'—^5'-экзонуклеаза/ДНК-полимераза (экзо/пол) рассчитывали как отношение количества выщеп-ленных из ДНК нуклеотидов (пмоль) к количеству включенных в ДНК нуклеотидов (пмоль), причем концентрации лимитирующих субстратов составляли 0.1 величины константы Михаэлиса (т.е. 4 мкг/мл [3'-3И]ДНК для экзонуклеазы и 1 мкМ [3H]TTî для ДНК-полимеразы); экзонуклеазную и полимеразную активности измеряли в параллельных опытах.
При хроматографии на колонках с сефакри-лом S-300 и сефадексом G-100 элюирующий раствор содержал: 0.05 M mpuc-HCl буфер, pH 7.4, 0.1 M NaCl, 10%-ный глицерин, 2 мМ 2-МЭ, 0.1 мМ ФМСФ (рис. 1, 3 и 4а), 1 M NaCl добавляли к этому буферу при хроматографии, представленной на рис. 2 и 46.
Действие КЭ на точность синтеза ДНК изучалось с помощью фаговых праймер-матриц. Вкратце, смысл метода заключается в следующем. Синтетический праймер гибридизуется с плюс-нитью ДНК бактериофага ÇX174 амбер 3, при этом З'-конец праймера располагается всего за три нуклеотида от точечной амбер-мутации в ДНК-матрице. Затем на праймер-матрице проводится ДНК-полимеразный синтез. Если при синтезе напротив амбер-кодона не возникло ошибки, то после трансфекции ДНК в сферопласты клеток E. coli не наблюдаются негативные колонии фага (но наблюдаются при использовании супрес-сорных клеток). Если же ДНК-полимераза ошиблась, продвигаясь напротив бессмысленного амбер-кодона (где при последующей трансляции в клетке происходит обрыв цепи соответствующего белка, необходимого для образования негативной колонии, т.е. лизиса клеток бактериального хозяина), то амбер-кодон превращается в смысловой кодон (т.е. происходит генотипическая или фенотипическая реверсия) во вновь синтезированной нити. В этом случае после трансфекции ДНК и в обычные клетки (а не только в супрес-сорные) наблюдаются негативные колонии фага вследствие его реверсии к дикому типу.
Гомогенные ДНК-полимеразу ß (39 кДа) и 3'—>-5'-экзонуклеазы (27 и 40 кДа) выделяли из печени крысы, как указано ранее (Shevelev et al., 2000).
Регенерацию печени вызывали частичной (2/3) гепатэктомией по методу Хиггинса и Андерсона (Higgins, Anderson, 1931).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение минимального комплекса ДНК-полимеразы ßи3'—"5'-экзонуклеазы. В экстрактах различных субклеточных фракций гепатоцитов крыс обнаруживаются надмолекулярные ДНК-полимеразные комплексы, проявляющие 3'—»-5'-экзонуклеазную активность (табл. 1). Только комплексы из хроматина содержат значительное количество ДНК-полимеразы ß (табл. 1).
ДНК-полимераза ß отличается от ДНК-поли-мераз а-семейства по устойчивости ее активности к действию N-ЭМи, молекулярной массе (39 кДа) и отсутствию 3'-экзонуклеазной активности у чистого фермента (Wang, 1991). Активность КЭ отличается от активности эндонуклеаз по превышению в 10 раз скорости выщепления одной и той же доли (%) радиоактивных нуклеотидов из меченной только по 3'-концам ДНК по
Таблица 1. Соочистка ДНК-полимераз с 3'—►5'-экзонуклеазами в процессе гель-фильтрации экстрактов субклеточных фракций гепатоцитов на колонке с сефакрилом S-300
Субклеточный препарат, время после частичной гепатэктомии, ч Молекулярная масса, кДа Отношение активностей 3' —»5'-экзонуклеазы (однонитевая ДНК) и ДНК-полимеразы Активность ДНК-полимеразы в присутствии 8 мМ Ы-ЭМИ, %
Комплекс из хроматина
нормальная печень 300-400 12 ± 7 35 ± 5
регенерирующая печень, 22 ч 300-400 6 ± 2 33 ± 6
Комплекс из нуклеоплазмы регенерирующей печени, 22 ч 250-350 0.5 ± 0.2 8 ± 1
Комплекс из ядерной мембраны
нормальная печень 1000-1500 8 ± 3 3.2 ± 0.3
регенерирующая печень, 22 ч 1000-1500 6.0 ± 3.5 4.5 ± 0.9
регенерирующая печень, 22 ч 400 2.7 ± 0.2 -
регенерирующая печень, 4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.