ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 2, с. 283-290
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1
КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ МУЛЬТИБЕЛКОВЫХ РАСТВОРИМЫХ КОМПЛЕКСОВ В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ
© 2014 г. Е. С. Пожидаева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 26.11.2012 г.
В настоящее время функциональная протеомика белков является одним из важнейших инструментов, используемых для изучения сложных внутриклеточных процессов, вовлекающих разнообразные белки, взаимодействующие между собой с различной долей вероятности. Большинство из них, выполняя свои функции в сложной сети взаимодействий, оказывают влияние на функции других белков. Несмотря на то, что многие из компонентов таких "белковых сетей" могли быть ранее охарактеризованы индивидуально, это не давало полной информации о характере и составляющих предполагаемых взаимодействий в естественных условиях. В статье описаны методы (нативный гель-электрофорез, эксклюзионная хроматография и иммунопреципитация), наиболее эффективно применяемые в протеомике взаимодействий и оптимизированные для изучения мультибелко-вых растворимых комплексов в клетках фотосинтетических бактерий на примере модельного объекта одноклеточной цианобактерии 8упесЬососст е1ощаШв РСС 7942.
Ключевые слова: 8упвсЬососст е1ощаШ5 — белковые комплексы — электрофорез — протеомика
Б01: 10.7868/80015330314010102
ВВЕДЕНИЕ
Цианобактерии являются уникальными прокариотами, так как им свойственен оксигенный фотосинтез, характерный для эукариотических водорослей и растений и являющийся важным биологическим процессом, обеспечивающим преобразование и запасание солнечной энергии, а также синтез углеводов и выделение кислорода. Биологическое разнообразие среди цианобакте-рий сделало их привлекательным объектом для использования в прикладных целях [1]. В частности, как потенциального поставщика предшественников биологических молекул, используемых при создании биофармацевтических препаратов [2], для получения молекулярного водорода [3], поскольку цианобактерии образуют водород за счет конверсии солнечной энергии, а также для удаления из окружающей среды тяжелых металлов [4].
По данным СуапоВа8е [5], к настоящему времени расшифрованы нуклеотидные последова-
Сокращения: ТВ — трис-боратный буфер; ATPyS — adenosine 5'-O-[3-thio]-triphosphate (аденозин-5'-0-[3-тио]-трифос-фат); Synechococcus — Synechococcus elongatus PCC7942. Адрес для корреспонденции: Пожидаева Елена Станиславовна. 126276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: alenapoj@mail.ru
тельности геномов 39 различных штаммов ци-анобактерий, что открывает большие возможности для дальнейших исследований, в том числе и для развития протеомики цианобактерий. В сочетании с другими научными подходами применение функциональной протеомики позволяет глубже понять ключевые аспекты биологии этих организмов и эффективно использовать их при решении различных задач. В связи с тем, что белки могут быть организованы в сложные комплексы с абсолютно разными свойствами, для изучения их состава и размера обычно применяют несколько основных методов. Важной составляющей про-теомного анализа является высокое разрешение и чувствительность разделения белков, которыми обладает классический метод двумерного электрофореза (2Э ШР/8В8), основанный на сочетании изоэлектрического фокусирования (ШБ) [6] и 8В8-РЛОБ [7]. К сожалению, данный метод не подходит для анализа гидрофобных белков вследствие их возможной агрегации в условиях 1БЕ Кроме того, он не может быть применен для анализа белков в нативном состоянии или для идентификации белков-партнеров.
В статье описан альтернативный метод двумерного гель-электрофореза, в котором фракционирование нативных белков и белковых комплексов в первом "направлении" осуществляли с
помощью: 1) бесцветного нативного электрофореза [8] в слабо щелочных условиях с использованием трис-боратного (ТВ) буфера; 2) на хромато-графической колонке методом эксклюзионной хроматографии [9] с использованием ВЭЖХ и 3) методом иммунопреципитации белков [10], с последующей комбинацией перечисленных методов с SDS-PAGE во втором направлении. Предложенный комплексный подход был оптимизирован нами для изучения состава и молекулярной массы мультибелковых растворимых комплексов в клетках фотосинтетических бактерий на примере модельного объекта одноклеточной цианобак-терии Synechococcus elongatus PCC 7942 [11]. Сочетание перечисленных методов позволило наиболее точно оценить молекулярную массу изучаемых комплексов и описать спектр составляющих их белков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы и условия культивирования. Штамм дикого типа Synechococcus elongatus PCC7942 (далее Synechococcus) выращивали в климатической камере фотоавтотрофно при температуре 32°С и постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью 70 мкмоль фотонов/(м2 с) на среде BG11 [12]. Для экспериментов использовали интенсивную культуру цианобактерий. Для этого клеточную культуру штаммов в логарифмической фазе роста предварительно разводили до концентрации хлорофилла 3 мкг/мл и подращивали в течение следующих 24 ч [13].
Разрушение клеток, экстракция и определение концентрации белка. Клеточный экстракт из ци-анобактерии Synechococcus получали методом Shukla с соавт. [14] c некоторыми модификациями. Для этого из 500 мл среды клетки Synechococcus осаждали центрифугированием (12 000 g, 4°C, 10 мин), осадок ресуспендировали в 5 мл охлажденного буфера для выделения, содержащего 50 мМ Hepes-KOH (pH 7.0), 0.5 мМ сахарозу, 15 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 2 мМ аденозин-5'-0-[3-тио]-трифосфат (ATPyS, от adenosine 5'-0-[3-thio]-triphosphate) и 0.001% раствор ингибиторов протеиназ ("Sigma", США). К суспензии клеток добавляли равный объем охлажденных стеклянных бус диаметром 0.10—0.25 мм ("Sigma") и разрушали клетки, встряхивая на вортексе (Мульти-вортекс V-32, "BioSan", Россия) 3 раза по 2 мин (с перерывом на 1 мин) на льду. Неразрушенные клетки и стеклянные бусы осаждали центрифугированием (2000 g, 4°C, 1 мин), и клеточный экстракт переносили в новую пробирку. Затем клеточный экстракт центрифугировали для разделения на фракции растворимых и мембранных белков при 25 000 g и 4°С в течение 45 мин. Супер-натант отделяли и использовали для определения суммарного растворимого белка с помощью би-
цинхонинового метода (ВСА assay kit, "Pierce", США) [15]. После этого образцы концентрировали с использованием центрифужных пробирок типа 10К Nanosep ("Pall Life Sciences", США) до необходимого объема и количества белка в образцах.
Двумерный электрофорез
Нативный гель-электрофорез. В первом (1D) направлении проводили разделение индивидуальных растворимых белковых комплексов в на-тивных условиях в трис-боратном (ТВ) буфере: 0.45 M Трис-HCl, pH 8.3, и 0.45 M борная кислота, при помощи 6—13% градиентного гель-электрофореза. Для этого 60 мкг суммарного белка растворимой фракции вносили в лунку 6—13% градиентного полиакриламидного геля размером 20 х 20 см (Protean II System, "BioRad", США). Для нанесения образцов использовали ТВ-буфер, содержащий 20% глицерин и 0.02% бромфеноло-вый синий. Электрофорез белков проводили в присутствии охлажденного ТВ-буфера с добавлением 1 мМ ЭДТА при постоянном токе 20 мА в течение 22 ч при 4°С. В качестве стандартов использовали белки-маркеры: ферритин (440 кД — мономер, 880 кД — димер), уреазу (272 кД — тример) и бычий сывороточный альбумин (БСА, 66 кД — мономер, 132 кД — димер) ("Sigma-Aldrich", США).
Эксклюзионная хроматография с использованием ВЭЖХ. Эксклюзионную хроматографию проводили при 4°С на колонке Superóse 6 HR 10/30 ("GE Healthcare", Швеция) объемом 24 мл, дающей распределение белковых молекул в диапазоне от 5 до 5000 кД. Растворимую фракцию, полученную, как описано выше, концентрировали (10K Nanosep, "Pall Life Sciences") до 4 мг/мл суммарного белка в образцах. Затем эту фракцию фильтровали (размер фильтра 0.45 мкм, Millipore) и вводили в колонку 0.1—0.2 мл образца. В качестве элюента наносили на колонку буфер, содержащий 25 мМ Hepes-NaOH (pH 7.4), 10 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, и 5 мМ АТФ. Белки разделяли со скоростью 0,3 мл/мин и фракции объемом 0.5 мл собирали с помощью коллектора автоматической хроматографической системы ВЭЖХ Akta Prime ("GE Healthcare"). Колонку калибровали стандартными белками с известной мол. м. с использованием альдолазы 158 кД, каталазы 232 кД, ферритина 440 кД, тироглобулина 669 кД и декс-трана синего 2000 кД (HMW Gel Filtration Calibration Kit, "GE Healthcare"). На колонку наносили 250 мкл индивидуального белка, конечная концентрация 1 мг/мл. После хроматографирования стандартов строили график зависимости константы элюирования и логарифма молекулярной массы, по которому определяли кажущуюся молекулярную массу исследованных белковых комплексов. Каждую из элюированных фракций этих
комплексов (50 мкл) наносили на нитроцеллю-лозную мембрану, используя прибор для дот-блоттинга ("Scie-Plas", Великобритания), и затем анализировали с помощью иммуноблоттинга.
Иммунопреципитация. Фракцию растворимых белков получали, как описано выше, с использованием холодного лизисного буфера 20 мМ Hepes-NaOH (pH 8.0), 150 мМ KCl, 0.1 мМ ЭДТА, 10 мМ MgCl2, 0.2% глицерин и 2 мМ ATPyS. Затем образцы концентрировали и смешивали с равным объемом (или большим) холодного фосфатно-со-левого буфера (PBS: 140 мМ NaCl, 8 мМ Na2P03, 2 мМ K2P03, 100 мМ KCl, pH 7.4, и 0.1% БСА). БСА добавляли в PBS-буфер непосредственно перед реакцией. Иммунопреципитацию проводили по методике производителя (Seize® X Protein A Immunoprecipitation Kit, "Pierce"). Для этого на каждую колонку, заполненную аффинным сорбентом протеин А-сефарозой, наносили 150 мкг очищенных IgG против белка ClpC в объеме 300— 400 мкл, предварительно разведенных в PBS-бу-фере. Затем на колонку наносили 400 мкл растворимой фракции, содержащей 400 мкг суммарного белка (конечная концентрация 1 мкг/мкл). После инкубации в течение часа при комнатной температуре колонку переносили в холодную комнату и и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.