ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 4, с. 429-446
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.468:631.86.:631.445.2.:631.452
КОМПЛЕКСНЫЙ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ МЕТОД ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ*
© 2015 г. А. В. Якушев
Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы
e-mail: ajyakushev84@mail.ru Поступила в редакцию 13.08.2014 г.
Предложен оригинальный комплексный структурно-функциональный метод для характеристики почвенных сообществ. Новизна подхода заключается в изучении микроорганизмов in situ не на уровне таксонов или крупных функциональных групп, а на основе кинетики роста микробных ассоциаций в селективных условиях в жидких питательных средах. Метод основан на анализе параметров комплексной модели роста периодической культуры. Кинетические параметры таких ассоциаций отражают метаболическую готовность микроорганизмов к росту на питательной среде и их физиологическое состояние. Способность к росту на различных средах — их физиологическое разнообразие. В результате полученные параметры определяются особенностями экологических стратегий микроорганизмов. Посев на плотную среду из исходного инокулята позволяет охарактеризовать таксономический состав доминантов почвенного сообщества. Посев из ассоциаций, сформировавшихся на селективных питательных средах, характеризует состав синтрофных группировок, выполняющих определенную функцию в природе. Данный метод является значительно более информативным по сравнению с классическими методами посева на селективные питательные среды.
Ключевые слова: микробные ассоциации, кинетика микробного роста, экологические стратегии микроорганизмов, дождевые черви, торф.
DOI: 10.7868/S0032180X15040115
ВВЕДЕНИЕ
Одна из целей почвенного микробиолога — выяснить, какой микроорганизм и с какой скоростью осуществляет тот или иной процесс непосредственно в почве. Достичь этого можно структурно-функциональной характеристикой микробного сообщества. Под структурной характеристикой понимается таксономический состав почвенного микробного сообщества. Функциональная характеристика включает в себя информацию о протекании микробиологических процессов в почве. Структурно-функциональная характеристика посредством определения физиологических групп микроорганизмов в почве методом посева на "селективные" агаризованные среды давно показала свою ограниченность в применении [5]. Остается неизвестным физиологическое состояние микроорганизмов. Численность и активность для микроорганизмов являются двумя разными характеристиками. Функциональная специализированность почвенных микроорганизмов была преувеличена. Существует мало почвенных микроорганизмов,
* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12-04-01170-а, 13-04-00536-а и гранта РНФ № 14-14-00625, 14-5000029 (эксперименты с многоножками).
специализирующихся на одном процессе: микроорганизм проводит различные процессы целенаправленно или при кометаболизме. До сих пор нет единого структурно-функционального метода.
Разовьем идею выделения физиологических групп микроорганизмов на новом уровне микробных ассоциаций. В природе микроорганизм трансформирует попавший в почву пищевой субстрат не в одиночестве (как на "селективной" ага-ризованной среде), а синтрофно — в ассоциации с другими микроорганизмами.
Цель исследования — разработать комплексный культуральный метод, одновременного изучения состава и физиологического разнообразия микробных популяций, их стратегии роста и физиологического состояния по параметрам роста и таксономическому составу жидких накопительных культур (ассоциаций). Суть и новизна подхода заключаются в объединении нескольких методов в логически связанное единое целое: метод почвенной накопительной культуры (сукцесси-онный подход) Виноградского [2] реализуется для различных физиологических условий роста посредством инокуляции жидких сред почвенной суспензией как при мультисубстратном тестировании (БЮЬОО БеоР1а1е8 и Ёип§1Ьо§) [3] с теоре-
тическим описанием динамики роста аналогично кинетическому методу определения микробной биомассы в почве [9, 21]. Состав исходной суспензии и возникших ассоциаций определяется чашечным методом [7], дополненным методом описания динамики появления микробных колоний [17] и достижениями молекулярно-генетиче-ской идентификации микроорганизмов по результатам секвенирования фрагмента нуклеотидных последовательностей ДНК гена, кодирующего 16S рРНК с использованием программы BLAST. Метод апробирован для почвенно-экологических исследований, но подход универсален и может применяться для микробных комплексов водоемов, производственных ассоциаций микроорганизмов в биотехнологии и при изучении физиологии чистых культур. Комплексный структурно -функциональный метод характеристики микробных популяций (комплексный метод) — развитие кинетического метода определения физиологического состояния микроорганизмов in situ [14].
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Изучали природные бактериальные и грибные комплексы. Непосредственными объектами были культивируемые гетеротрофные аэробные и факультативно-анаэробные бактерии и грибы, формирующие синтрофные ассоциации. Син-трофные ассоциации — культуры микроорганизмов, растущие вместе на одной жидкой питательной среде в условиях перемешивания, когда они могут взаимодействовать друг с другом непосредственно или через метаболиты. Именно ассоциации являются новым типом операционных таксономических единиц, выступающих в качестве объекта исследования. Исследованы вермиком-посты из навоза крупного рогатого скота, полученные с применением компостных червей Eise-nia fétida ООО "Флора-Л" и ООО "Русский биогумус" (pH водный = 8.15 ± 0.19, N орг = 1.797 ± ± 0.003%, C орг = 21.89 ± 0.135%). Модельные компосты и вермикомпосты получали в ходе лабораторного 6-месячного культивирования E. fétida на опаде мелколиственных пород деревьев (рН водный 8.90 ± 0.5, N орг 1.34 ± 0.03, C орг 36.76 ± 0.15), навозе крупного рогатого скота (рН водный 8.87 ± 0.24, N орг 1.39 ± 0.01, C орг 21.40 ± 0.16) и культивирования дождевых червей Aporrectoda caliginosa на низинном торфе (рН водный 6.33 ± 0.22, N орг 2.18 ± 0.01, C орг 35.06 ± 0.3). Так же исследовали микробные комплексы свежих (суточных) копролитов и навоза крупного рогатого скота — субстрата, в котором жили E. fétida (корм) в ходе трех модельных экспериментов; копролиты A. caliginosa и корма — гор. А пах чернозема выщелоченного, агроторфя-ной почвы, дерново-подзолистой почвы, гор. А чернозема обыкновенного + 10% дубового опада,
урбанозема; копролиты Lumbricus terrestris и экскременты личинок комаров-толстоножек (сем. Bibionidae, род Bibio sp.) и корма — опада широколиственных пород деревьев. Сравнивали опад (корм) и старые экскременты крымских ки-всяков Pachyiulus flavipes, а также образцы из горизонтов верховых (рН солевой 2.5—4, степень раз-ложенности 5—10%) и низинных торфяных почв (рН солевой 5.6—6.1, зольность 7—13%), отобранные в июне и августе 2010 г. до глубины 1 м на территории Западнодвинского лесо-болотного стационара Института лесоведения РАН Тверская обл. и до глубины 3 м в июне—августе 2009 г. из болотных массивов Западной Сибири (Томская обл.): олиго-трофного "Полынянка" 57°03' с.ш., 82°42' в.д. (рН солевой 2.6—5.2, зольность 3—6%) и евтроф-ного "Таган" 56°21' с.ш., 84°47-48' в.д. (рН солевой 5.7—6.2, зольность 9—14%).
Определение рН проводили потенциометри-чески. Содержание в органическом веществе С, N в высушенных и измельченных образцах определяли на элементном анализаторе Vario EL III (Elementar) HCNS Mode. Зольность исследовали прокаливанием в муфельной печи по стандартной методике.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Модель периодического роста микроорганизмов в жидких средах. Метод основан на описании роста ассоциаций микроорганизмов. Предлагается предельно упрощенная (с привлечением минимального количества параметров и уравнений) но механистическая (теоретическая) квазигомогенная структурированная "комплексная модель" чистой культуры.
Модель оперирует параметром среды s0 — начальной концентрацией ростового субстрата s (г/л) и параметрами культуры: х0 — начальное значение концентрации культуры х в питательной среде; ?лаг — значение времени t когда кончается лаг-период, ч; — максимальное значение удельной скорости роста ч-1; р0 — начальное значение переменной физиологического состояния растущей культуры р; у = —1п(р0) — метаболическая готовность культуры к росту на питательной среде; константа полунасыщения (г/л) Кр = s при р = 0.5рт, где рт = 1 — максимальное значение р; У — экономический коэффициент роста микроорганизмов на пищевом субстрате, У = (хт — —х0)/у0, где хт — максимальная концентрация культуры; ат — максимальная удельная скорость отмирания, ч—1; тотм — время начала экспоненциального отмирания, ч; п0 — значение переменной физиологического состояния п отмирающей культуры в момент начала экспоненциального
отмирания; 1п(п0) = 8 — метаболическая готовность культуры противостоять отмиранию.
При г < Тотм
dp dt
dx dt = ЦЯ,
s Ц = Ц mp ^ K р +
ds ЦК
dt Y' г
= Ц mP s
кр + s
t = _ ln(po)
При t > то
-ax,
йх йт йа
— = -атП, й т
= -атц(1 - П)-
йт
Динамика выхода отдельных клеток из лаг-фазы в рамках комплексной модели лаг-периода описывается уравнением
P'(t) = ■
Po
рехода к экспоненциальному росту, а это большой недостаток;
2) глаг кон — момент окончания переходной фазы когда удельная скорость роста культуры ц = — максимальному значению [10], однако ^ асимптотически приближается к и глаг кон нельзя выразить математически точно;
d2ln1 x
3) t
лаг экстр
время, когда -
dt2
в модифици-
(1 - Ро)е ^ + Ро
где ц 'т — максимальная удельная скорость подготовки метаболической системы клеток к росту на среде; р0 — интегральное физиологическое состояние растущей культуры микроорганизмов, определяющее изначальную готовность к выходу из лаг-фазы конкретной клетки.
Для обоснования комплексной модели рассмотрим лаг-период, то есть фазу подготовки микроорганизмов к росту на питательной среде, включающую стадии: 1) первоначального отмирания, 2) стационарную, 3) перехода к экспоненциальному росту. Лаг-период целиком или отдельные стадии
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.