ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2010, том 52, № 7, с. 1090-1101
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА
УДК 541.(64+49)
КОМПЛЕКСЫ АНИОННЫХ ЛИПОСОМ С КАТИОННЫМ ПОЛИМЕРОМ: СОСТАВ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА1
© 2010 г. Д. А. Давыдов*, А. А. Рахнянская*, В. Н. Орлов**, А. В. Бычкова***, А. Л. Коварский***, А. А. Ярославов*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы **Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского
119991 Москва, Ленинские горы ***Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
119334 Москва, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 26.10.2009 г.
Принята в печать 28.12.2009 г.
Исследована адсорбция синтетического поликатиона поли-М-этил-4-винилпиридиний бромида (ПЭП) на поверхности бислойных липидных везикул (липосом). Использованы два типа липосом: традиционные двухкомпонентные липосомы, сформированные из нейтрального фосфатидилхоли-на (ФХ) и анионного дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ2-), и анионные липосомы ФХ/КЛ2- со встроенным в бислой неионогенным ПАВ — цетиловым эфиром полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 20 (Бридж-58). ПЭП количественно связывается с обоими типами липосом; процесс носит электростатический характер и полностью обратим. Появление слоя полиэтиленгликоля на липосомальной мембране приводит к уменьшению стабильности комплексов поли-катион—липосома в водно-солевых средах. Адсорбция ПЭП на поверхности липосом ФХ/КЛ2- сопровождается их агрегацией; липосомы ФХ/КЛ2—/Бридж не агрегируют даже при полной нейтрализации их заряда адсорбированным ПЭП. Методом ДСК показано, что адсорбция поликатиона сопровождается микрофазовым разделением в липосомальной мембране: образованием доменов, состоящих преимущественно из молекул КЛ2—, связанных в комплекс с ПЭП, и областей, в которых сосредоточены в основном электронейтральные липиды. С помощью спинового зонда оценена плотность упаковки бислоев (их микровязкость) и высказано предположение о предпочтительной локализации зонда по границам липидных доменов в мембране липосом ФХ/КЛ2-/Бридж. Обсуждаются причины агрегативной устойчивости трехкомпонентных липосом ФХ/КЛ2—/Бридж и структура полученных комплексов полимер—липосома.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время сферические бислойные ли-пидные везикулы (липосомы) активно используются в качестве контейнеров для инкапсулирования и контролируемого высвобождения лекарственных веществ [1]. Наибольший прогресс достигнут в косметологии. Показано, что добавление липосом, содержащих во внутреннем объеме лекарства, в косметические гели и эмульсии способствует восстановлению рогового слоя кожи, проникновению в нее лекарственных веществ, увлажнению кожного покрова и т.п. [2—5]. Есть примеры коммерчески доступных инъекционных липосомальных препаратов
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 08-03-00744 и 09-03-12336).
E-mail: dimitri.davydov@gmail.com (Давыдов Дмитрий Александрович).
для лечения онкологических и инфекционных заболеваний [6].
Способность липосомальных контейнеров удерживать и высвобождать заключенное в них лекарство во многом определяется свойствами липосомальной мембраны. Последние в свою очередь зависят от того, какие липиды были использованы для приготовления липосом, от фазового состояния липидного бислоя, размера ли-посом и ряда других параметров [7]. На проницаемость мембраны можно влиять, связывая липосомы в комплексы с синтетическими и природными полимерами. Адсорбция полимеров на липосомальной мембране может сопровождаться возрастанием скорости миграции липидов между внешней и внутренней сторонами бислоя [8], возникновением трансмембранной асимметрии в распределении липидов [9, 10], формированием сквозных пор (каналов) в мембране [11, 12] и дру-
-2.5
-1.5
s s
<ч о
ч ^
к > -0.5
Св и
W >
о 2
2 м
IS
(U &
о Ф 5 о се
я
м
(U
ч
н 1400
- 1000
- 600
-200
2 3
[ПЭП] х 104, моль/л
се S
Рис. 1. Зависимость электрофоретической подвижности и гидродинамического диаметра частиц в системе ПЭП-ли-посомы от концентрации ПЭП: 1, 3 — липосомы КЛ2-/ФХ, Vj = 0.2; 2, 4 — липосомы КЛ2-/ФХ/Бридж, Vj = 0.2, V2 = 0.22. Общая концентрация липидов + Бридж 1 мг/мл; [КЛ2-] = 2.8 х 10-4 моль/л; боратный буфер, 0.01 М; pH 9.2.
гих дефектов, что в конечном итоге ускоряет выход лекарства из липосомального контейнера в окружающий раствор [13]. Особый интерес представляют электростатические комплексы анионных липосом с катионными полимерами. Помимо относительно мягкого воздействия на проницаемость мембран (без разрушения липосом) такая модификация приводит к перезарядке ли-посом и придает им аффинность по отношению к клеткам, которые, как известно, несут поверхностный отрицательный заряд [14].
В настоящей работе исследовано комплексо-образование катионного полимера поли-М-этил-4-винилпиридиний бромида (ПЭП), с малыми мо-ноламеллярными анионными липосомами. Были использованы два типа липосом: 1) традиционные липосомы, сформированные из смеси анионного дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ2-) и цвиттер-ионного (нейтрального) фосфатидилхоли-на (ФХ); 2) анионные липосомы ФХ/КЛ2-, в мембрану которых были дополнительно встроены молекулы неионогенного поверхностно-активного вещества Бридж-58, эфира ПЭГ со степенью полимеризации 20 и цетилового спирта. Гидрофи-лизация поверхности липосом ПЭГ-слоем позволяет существенно увеличить время их циркуляции в организме и уменьшить терапевтическую концентрацию лекарств [15, 16]. За связыванием поликатиона на липосомальной мембране следили по изменению поверхностного заряда липосом, их размера и интенсивности флуоресценции метки, встроенной в липосомальную мембрану, используя методы
лазерного микроэлектрофореза, фотонной корреляционной спектроскопии и тушения флуоресценции. Структурные перестройки в мембране, инициированные адсорбцией поликатиона, анализировали методами ДСК и ЭПР. Полученные результаты и сделанные на их основе выводы важны для понимания механизма взаимодействия полимеров с липо-сомами и разработки смешанных контейнеров на основе липосом и полимеров для транспорта лекарственных веществ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы Катионный полимер ПЭП
С2Н5
получали кватернизацией поли-4-винилпири-дина со степенью полимеризации 600 фирмы "АМпсЬ" бромистым этилом в 10%-ном спиртовом растворе [17]. Полученный продукт осаждали из реакционной смеси в сухой диэтило-вый эфир, осадок промывали эфиром и сушили в вакууме. Степень алкилирования, определенная методом ИК-спектроскопии, составила 95%. Концентрацию полимера рассчитывали
в молях катионных (кватернизованных) групп на литр раствора.
ФХ и дипальмитоилфосфатидил холин (ДПФХ), КЛ2-, 1,2-диолеоилглицеро-3-фос-
фоэтаноламин-М(карбоксифлуорес-цеин) (ФЭА-КФ) (все фирмы "Avanti") и Бридж-58 ("Serva") использовали без дополнительной очистки.
НзЯ©
H3^N-(CH2)2X
O \
-o-p=o
I
OH
НО
*3C / H3C
H2C-/
H2C—CH
2
2 I
0
O=C
1
R
1
0
C=O
1
R2
O ©
ФХ, ДПФХ
0
H°-P-°
1
0
Ch2
1 2
H2C—CH
O
°-P-°H I
O
I
CH
I
2
121
0
O=C
1
R
I
0
C=O
1
R2
HC—CH
I
0
O=C
1
R1 R
КЛ-
I 2
0
C=O
1
2
h2c-
2 I
O
°=C
O
H2
c2 OC H2
'H
22
c-o©
O=C I
NH
0
1
O=P-°© I
0 \
CH2 / 2 -CH
1
0
C=O
1
C17H33 C17H33
CH3
Бридж-58
ФЭА-КФ
где R1, R2 — остатки природных насыщенных и ненасыщенных карбоновых кислот (ФХ) и ^ = R2 = С15Н31 (ДПФХ).
Малые моноламелярные липосомы ФХ/КЛ2-получали методом экструзии. Для этого соответствующие количества растворов липидов в хлороформе смешивали в стеклянной колбе, после чего удаляли органический растворитель на вакуумном роторном испарителе Laborota 4000 ("Не1ёо1рИ") при 38°С. Образовавшуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл 0.01 М бо-ратного буфера (рН 9.2). Полученную суспензию пропускали через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 100 нм 30 раз. Гидродинамический диаметр липосом, определенный методом динамического светорассеяния, составлял 90-100 нм.
Малые моноламелярные липосомы из ДПФХ и КЛ2-, а также трехкомпонентные липосомы ДПФХ/КЛ2-/Бридж-58 получали по указанной выше методике при температуре 50°С. При изме-
рении интенсивности флуоресценции использовали липосомы со встроенной флуоресцентной меткой.
В этом случае к смеси растворов липидов добавляли раствор, содержавший 0.01 мг ФЭА-КФ (0.05 мас. % от общего содержания липидов).
Для определения локальной вязкости липид-ного бислоя методом ЭПР-спектроскопии спиновых зондов в липосомы вводили стабильный нитроксильный радикал 16-доксилстеариновую кислоту (ДС-16). С этой целью к суспензии липидов добавляли спиртовой раствор, содержащий 0.015 мг ДС-16. Концентрация зонда во всех пробах составляла ~2 х 10-5 моль/л. Формула зонда и его движение в липидном бислое схематично представлены ниже. Тетраборат натрия, №2В407 • 10Н20, и хлорид натрия (марки х.ч.) использовали без дополнительной очистки.
Воду для приготовления растворов ПЭП, ли-посом и низкомолекулярных солей получали двойной перегонкой с последующей очисткой на системе Milli-Q ("Millipore"), включающей ионообменные и адсорбционные колонки для глубокой очистки от органических примесей и фильтр для удаления крупных частиц. Очищенная таким образом вода имела удельную электропроводность 0.056 мкСм/см.
Методы
Гидродинамический диаметр (размер) липо-сом и их комплексов с поликатионом оценивали методом динамического светорассеяния с помощью прибора Brookhaven 90 Plus ("Brookhaven Instruments") при фиксированном угле 90°. Флуктуации интенсивности света регистрировали с помощью коррелятора "Brookhaven 90 Plus" ("Brookhaven Instruments"). Величины гидродинамических радиусов рассчитывали с использованием уравнения Стокса в приближении сферических частиц.
Электрофоретическую подвижность липосом и их комплексов с поликатионами измеряли с использованием лазерного микроэлектрофореза на приборе Brookhaven 90 Plus ("Brookhaven Instruments") по стандартной методике в термостатиру-емой ячейке при температуре 22°С.
Интенсивность флуоресценции р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.