научная статья по теме КОМПЛЕКСЫ МЕДИ(II) КАК МОДЕЛЬ ЛАККАЗЫ В РЕАКЦИИ КАТАЛИТИЧЕСКОГО УДАЛЕНИЯ ФЕНИЛГИДРАЗИДНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ В МЯГКИХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ Химия

Текст научной статьи на тему «КОМПЛЕКСЫ МЕДИ(II) КАК МОДЕЛЬ ЛАККАЗЫ В РЕАКЦИИ КАТАЛИТИЧЕСКОГО УДАЛЕНИЯ ФЕНИЛГИДРАЗИДНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ В МЯГКИХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Том 19 * № 1 * 1993

УДК 541.128.1 +577.15.02

© 1993 А. Н. Семенов, И. В. Ломоносова, М. И. Титов

КОМПЛЕКСЫ МЕДИ (II) КАК МОДЕЛЬ ЛАККАЗЫ В РЕАКЦИИ КАТАЛИТИЧЕСКОГО УДАЛЕНИЯ ФЕНИЛГИДРАЗИДНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ В МЯГКИХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Российско-германское совместное предприятие «Константа», Москва

Показано, что комплексы меди(II) с азотсодержащими лигандами (пиридин, имидазол) эффективно имитируют каталитическую активность лакказы в реакции окислительного удаления фенил-гидразидной защитной группы. Процесс деблокирования протекает в мягких условиях, исключающих окисление лабильных аминокислот. Изучено влияние различных факторов на скорость реакции деблокирования и степень конверсии. Определены оптимальные условия, в которых процесс деблокирования протекает количественно.

Фенилгидразидная защитная группа лишь эпизодически используется в практике пептидного синтеза для временного блокирования карбоксильной функции. Главное ограничение, препятствующее широкому применению этой защитной группы,— жесткие условия окислительного деблокирования, не исключающие протекания побочных реакций (см. обсуждение в [1]).

В предыдущей работе [1 ] мы показали, что ферменты класса оксидоредуктаз можно эффективно использовать для селективного удаления фенилгидразидной защитной группы в мягких окислительных условиях. Пероксидаза и лакказа катализируют окисление фенилгидразидной группы, блокирующей карбоксильную функцию, до высокоактивного и неустойчивого фенилдиимида, который в присутствии воды самопроизвольно распадается с образованием азота, бензола и свободной карбоксильной группы:

И—СО—КНЫН—С6Н5-^ Я—СО—N=N—^11,И—СО—ОН + М2 + СбН6.

Наиболее перспективным с практической точки зрения представляется использование лакказы [1 ].

Введение в практику пептидного синтеза защит, селективно удаляемых в мягких окислительных условиях, способствует построению полностью ортогональной системы защитных групп для карбоксильной функции [2 ]:

Защитные группы, удаляемые в щелочных условиях (-ОМе, -ОЕ1 ) Защитные группы, удаляемые . Защитные группы, удаляемые в

в восстановительных условиях *- Т -» окислительных условиях

(-ОВг1 ) ' (-1ШМ1СбНз )

Защитные группы, валяемые в кислых условиях -ОВи' )

Используемые сокращения: БМ50 — диметилсульфоксид, ЭМР — диметилформамид, ИСС — дициклогексилкарбодиимид, НВТ — >}-гидроксибензотриазол, Ру — пиридин, 1т — имидазол, Ме1т — М-метилимидазол, БМАР — диметиламинопиридин.

В то же время мы показали [1 ], что ферментативное деблокирование может быть лишь ограниченно использовано для деблокирования пептидов, плохо растворимых в воде, так как активность ферментов, в частности лакказы, подавляется в водно-органических смесях с высоким содержанием неводного компонента. Один из подходов, позволяющий решить проблему инактивации биокатализаторов в денатурирующих условиях, заключается в создании и использовании таких химических моделей биокатализаторов (ферментов), которые сохраняют в достаточной степени практически ценные функциональные свойства ферментов и в то же время эффективно функционируют в неприродных (денатурирующих) условиях [3—5 ].

В настоящей работе мы представляем низкомолекулярную химическую модель, которая эффективно имитирует лакказную активность в реакции окислительного удаления фенилгидразидной защитной группы и в то же время сохраняет активность в средах с высоким содержанием неводного компонента. Следовательно, предлагаемая нами химическая модель лакказы может быть использована как катализатор в реакции деблокирования водонерастворимых пептидов.

Химическая модель активного центра лакказы. Лакказа относится к так называемым голубым оксидазам, в активном центре которых расположены ионы меди. В частности, активный центр лакказы содержит 4 иона меди — один ион I типа, один ион II типа и два иона III типа. Классификация ионов меди сделана на основе их спектральных и электрохимических свойств. В лигандное окружение ионов меди входят имидазол, атомы серы и, возможно, вода. Стандартный окислительно-восстановительный потенциал ионов меди I и II типов равен + 0,785 и +0,782 В соответственно, что существенно выше, чем окислительно-восстановительный потенциал неорганического иона меди. Важно заметить, что аномально высокое значение потенциала связывают обычно с лигандным окру жением меди в активном центре. Другой важной особенностью строения активного центра лакказы является то, что два иона меди III типа находятся, вероятно, в непосредственной близости друг от друга и благодаря этому могут осуществлять скоординированный двухэлектронный перенос [6 ].

Низкомолекулярная химическая модель лакказы, очевидно, должна содержать ионы меди и лигандное окружение, структурно и, что более важно, функционально имитирующее лигандное окружение в активном центре фермента.

Химическое деблокирование. На рис. I представлены кинетические кривые, описывающие процесс деблокирования модельного трипептида H-Phe-Trp-Gly-NHNHC6H5. Окислителем в данном процессе является кислород воздуха. Процесс окислительного деблокирования катализируется ионами меди (кривая 1) или ионами меди в присутствии лигандов (кривые 2—6). Обращает на себя внимание тот факт, что скорость реакции заметно возрастает в присутствии азотсодержащих лигандов, например пиридина, имидазола, метилимидазола и т. д. Комплексы ионов меди с этими лигандами имитируют каталитическое действие лакказы и, следовательно, могут рассматриваться как ее низкомолекулярная химическая модель.

По данным Коле с соавт. [7 ], минимальный активный центр лакказы представляет собой трехъядерный кластер, включающий ионы меди II и III типа. Комплексы ионов меди с низкомолекулярными лигандами вряд ли содержат более 2 ионов меди [4 ]. Следовательно, предлагаемая нами модель — скорее функциональная, нежели структурная, имитация активного центра лакказы.

Важная особенность ферментативного катализа — специфичность взаимодействия фермент—субстрат [8 ]. Ранее было показано, что ионы меди и кобальта в присутствии некоторых азотсодержащих лигандов обладают способностью катализировать электрохимическое четырехэлектронное восстановление кислорода [9 ]. Это явление рассматривалось с точки зрения моделирования активного центра оксидаз. Сравнение относительной эффективности различных ионов указывает на специфичность взаимодействия комплексов меди и кобальта с кислородом — субстратом оксидаз [9]. В настоящей работе показано, что пиридиновые

з*

67

[S],mM

мин

Рис. 1. Катализируемое ионами меди удаление фенилгидразидной защитной группы с трипептида H-Phe-TrD-Gly-NHNHC6H5(S): / — Cu, 2 —Cu(Py>„ , i — Cu(Im)„2+, 4 — Cu(Melm)„ , 5 — Cu(DMAP)„2+, 6 — Cu(Lys)„. Условия реакции: 0,2 M фосфатный буфер (рН 4,6), 2% DMSO, [S] 1 мМ, [Си2+] 0,1 мМ,. концентрация лиганда во всех случаях равна 50 мМ

Рис. 2. Зависимость эффективности удаления фенилгидразидной защитной группы с трипепгида Н-РЬе-Тгр-Оу^НЫНСбШ [8], катализируемого комплексами меди с ниридином (кривая I) и имидазолом (кривая 2) от концентрации лиганда. Условия реакции см. рис. 1. Реакцию инициировали добавлением водного раствора СиСЬ до концентрации 0,1 мМ и через 15 мин определяли содержание свободного пептида методом ВЭЖХ. Кривые 3—6 указывают относительное содержание в реакционной смеси комплексов меди [Си(Ру)л]2+ в зависимости от концентрации пиридина: п- 1 (3), п-2 (4), п-Ъ О), п-4 (б) (рассчитано по данным работы [И])

комплексы кобальта в отличие от аналогичных комплексов меди не катализируют окислительное удаление фенилгидразидной защитной группы. Это указывает на то, что комплексы меди в отличие от комплексов кобальта являются специфическими катализаторами для снятия фенилгидразидной группы. Следовательно, можно говорить о наличии в случае медных комплексов специфичности взаимодействия катализатор—субстрат (здесь имеется в виду второй субстрат лакказы — фенилгидразид пептида).

В присутствии лизина (кривая 6) процесс практически не ускоряется. Это

лмг, %

Рис. 3. Зависимость эффективности удаления фенилгидразидной группы с трипептида Н-Р11е-Тгр-С1у^НГ'ШСбН5 [5], катализируемого комплексом меди с пиридином в смеси ЭМИ/вода, от содержания БМР. Условия реакции: 0,2 М ацетатный буфер (рН 4,0), 2% БМЗО, [Б] 1 мМ, [Ру] 20 мМ. Реакцию инициировали добавлением водного раствора СиСЬ до концентрации 0,4 мМ и через 30 мин методом ВЭЖХ определяли содержание свободного пептида

достаточно удивительно, если учесть, что комплекс меди с лизином имитирует активность другой медьсодержащей оксидоредуктазы — супероксиддисмутазы [Ю].

Наиболее эффективные катализаторы — комплексы меди с пиридином, ими-дазолом или 1Ч-метилимидазолом. По-видимому, пиридин и имидазол действуют по сходному механизму и ускоряют одну и ту же стадию, так как при их совместном присутствии в реакционной смеси не наблюдается эффект синергизма (данные не приведены). Возможно также (но менее вероятно), что в присутствии пиридина и/или имидазола скорость процесса лимитируется другой стадией (см. ниже — Скоростълимитирующая стадия).

Азотсодержащие лиганды в отсутствие ионов меди не катализируют реакцию удаления фенилгидразидной группы (данные не приведены).

При изучении зависимости эффективности деблокирования в присутствии комплекса меди от концентрации лиганда (рис. 2) показано, что избыток имидазола ингибирует процесс. Интересно, что и каталазная (каталитическое разложение перекиси водорода) активность комплексов меди также максимальна в случае комплексов с незаполненной координационной сферой [3]. В случае пиридина (рис. 2) вплоть до концентраций лиганда 0—0,20 М не удалось обнаружить его ингибирующего действия. На рис. 2 представлены также рассчитанные по данным работы [И] зависимости относительного содержания разных форм комплексов меди с пиридином ЦСи(Ру) ]2+, [Си(Ру)2]г+, [Си(Ру)3]2+ и [Си(Ру)4И от его концентрации. Максимум активности пиридиновых комплексов меди наблюдается при концентрации пиридина 0,04 М и выше (кривая 1). При этих концентрациях пиридина в реакционной смеси присутствуют преимущественно комплексы меди: [Си(Ру)2]2+ (кривая 4), [Си(Ру

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком