БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 20 * № 1 * 1994
УДК 547.963.07:577.6:544
© 1994 А. С. Левина, Д. Р. Табатадзе, В. Ф. Зарытова, М. И. Добриков, В. В. Горн, С. Г. Лохов
КОМПЛЕМЕНТАРНО-АДРЕСОВАННАЯ ФОТОМОДИФИКАЦИЯ ДНК-МИШЕНЕЙ АРИЛАЗИДНЫМИ И ПЕРФТОРАРИЛАЗИДНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
IV*. ФОТОМОДИФИКАЦИЯ ss- И ds ДНК-ФРАГМЕНТОВ
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН
Осуществлена высокоэффективная сайт-специфическая фотомодификация ss- и ds-ДНК-мишеней с использованием производного гексадекатимидилата, R — р(Т)!6 (R — п-азидотетрафторбензамидная группа), в условиях образования триплексов. В качестве мишени были использованы 27-звенные фрагменты ss- и ds-ДНК:
7
5' GCGCACG (A)I6 GTCG
7 24
5' GCGCACG (А)м GTCG '
У CGCGTGC (Т),6 CAGC
22
Основными точками модификации для ss-ДНК являются основания G7 и G24, для ds-ДНК — G22 тимидин-богатой цепи и G7 аденозин-бога-той цепи. Степень фотомодификации ss-мишени достигает 60—77%, а ds-мишени — 10—53% в зависимости от условий реакции. Показано, что степень модификации повышается при проведении реакции в буфере с большой ионной силой (1,0 М) и при пониженной температуре (4° С), что связано с увеличением стабильности тройного комплекса.
Проблема сайт-специфического воздействия на двуцепочечные ДНК является актуальной задачей, перспективы решения которой наметились в последние годы. Такое воздействие стало возможным с помощью реакционноспособных производных олигонуклеотидов, образующих в определенных условиях тройные комплексы с комплементарными участками двуспиральной ДНК. В литературе описано использование алкилирующих [2, 3] и фотоактивных производных олигонуклеотидов для этой цели. Среди последних следует отметить олигонуклеотидные производные с остатками псоралена как эффективные и сайт-специфичные фотореагенты [ 4, 5]. Менее эффективными оказались производные олигонуклеотидов, несущие арилазидные группы [6—8], остатки порфиринов [9, 10] и эллиптицин [П].
Ранее нами было показано, что олигонуклеотидные реагенты, несущие перф-торарилазидную группу, эффективны для фотомодификации одноцепочечных ДНК[ 12,13].
'Сообщение III см. [1]. Префикс «d» в обозначении дезоксиолигонуклеотидов опущен. Сокращения: ss-ДНК, ds-ДНК — однонитевая и двунитевая ДНК.
Температура плавления триплексов (I) (I1) (I) и (I) •( 1I) ( III) и соответствующих дуплексов (1)-(Н) и (II) -(Ш) в буферах Б-1 и Б-2*
Комплексы
Температура плавления, °С
Б-1
Б-2
(!>(")
(1>(Н).(1)
(И).(Ш)
(!)■(»> (I")
49 49; 10
63 63; 15
59 58; 34 68 68; 32
Концентрация олигонуклеотидов 2-10 М во всех случаях, кроме комплекса (I) • (II) - (I), где концентрация И — р(Т)16 — 4 • Ю^5 М. Б-1—0,1 М 1лС1, 10 мМ трис-НС!, 1 ММ спермин, рН 7,5; Б-2—1,0 М ЫС1, 10 мМ трис-НС1, 1 мМ спермин, рН 7,5.
В настоящей работе исследована сайт-специфическая фотомодификация 27-звенных ее- и сЬ-ДНК-фрагментов в условиях образования тройных комплексов с помощью гексадекатимидилата, содержащего перфторарилазидную группу на 5'-концевом фосфате, И — р(Т)16 (1).
3'(T)16P-R (I)
7 24
5' pGCGCACG-(A)16-GTCG (II)
У R-p (Т)16 (I)
Комплекс (I) • (II) - (I)
5' pGCGCACG-(A)16-GTCG (II)
5/ R-p (Т)16 (I)
3' CGCGTGC-(T)16-CAGCp (III) Комплекс (I)-(II)-(III)
F F
CONH(CH2J,NH—
Известно [14], что образованию триплексов способствуют высокая концентрация соли, наличие двухвалентных ионов или полиаминов; кроме того, формирование тройных комплексов в отличие от дуплексов требует достаточно длительного времени. Эксперименты, описанные в настоящей работе, проведены в условиях образования триплексов.
Наличие тройных комплексов было подтверждено данными по их термической денатурации. Были определены температуры плавления комплексов (I) • (II). (I)- (Н> (I),(II) (III) и( I) • (Н> (III) в буферах Б-1 и Б-2 различной ионной силы (0,1 и 1,0 М соответственно) (табл. 1). На дифференциальных кривых плавления фиксируются два максимума, из которых более низкотемпературный соответствует плавлению триплекса, а более высокотемпературный — плавлению дуплекса. Как и следовало ожидать, стабильность комплексов значительно увеличивается в буфере с большей ионной силой (табл. 1).
Фотомодификацию проводили в буферах Б-1 и Б-2 при 4 и 22° С в условиях, описанных в работах [ 12,13]. Реакционные смеси после облучения анализировали с помощью гель-электрофореза (рисунок). Во всех случаях облучение вызывает образование ковалентных аддуктов — продуктов присоединения реагента (I) к
Радиоавтограф геля при электрофоретическом анализе вх- и дэ-ДНК-мишеней (комплексы (I) '(П)'(1) и(1) -(II)-(III)), подвергшихся облучению светом ртутной лампы ДРК 120 при 303-365 нм в буферах Б-1 и Б-2 при 4 и 22° С. Дорожки 1—4, 15—18 иллюстрируют модификацию пурин-богатой цепи (II) в комплексе (I)-(II)-(I); 5—8, 19—22 — той же цепи в комплексе (1)-(П)-(П1), 9—12, 23—26 — пиримидин-богатой цепи (III) в комплексе (1)-(Н)-(Ш). 1—12 — реакционные смеси до обработки пиперидином, 15—26 — после такой обработки. 13 и 14 — продукты расщепления депей (II) и (III) по остаткам пуринов. Состав буферов см. табл. 1. Концентрация мишени 5-Ю- М, реагента — 5-Ю-5 М. Звездочкой обозначена 5'-32Р-меченая цепь, в7, А8 и О24 — основания А-богатой цепи (II), О22 — основание Т-богатой цепи (III)
мишени (рисунок, 1—12). В случае комплекса (I)- (II) - (I) образуются ковалентные аддукты X, У, Ъ с различной .электрофоретической подвижностью (рисунок, 1—4). Подвижность фракции У совпадает с таковой для продукта присоединения реагента (I) к олигонуклеотиду (II) (А-богатая цепь) при облучении комплекса (I) • (II) • (III) (рисунок, 5—8) и близка к подвижности продукта присоединения реагента (I) к Т-богатой цепи (III) в этом же комплексе (рисунок, 9—12). Суммарный выход продуктов ковалентного присоединения реагента (I) к цепи (II) в комплексе (I) • (II) • (I) составляет 60—77% в зависимости от условий реакции. В комплексе (I)-(II)-(III) реагент присоединяется к обеим цепям (II) и (III) с выходами 27—37 и 6—16% соответственно. Выход ковалентных аддуктов существенно зависит от условий проведения реакции: повышается при охлаждении реакционной смеси, при использовании большого избытка реагента и буфера с большей ионной силой (табл. 2). При фотомодификации в буфере Б-1 с низкой ионной силой заметно влияние темпера-
Ктткс I-Ж-1 1-Ж-Ж 1-Ж-Ж 1-1*1 М-Ж 1-1-Ж*
Втер Б-2 Б-1 Б-2 6-1 Б~2 Б-1 Б-2 Б-1 5-2 Б-1 Б-2 Б-1
¿,С Ч 22 Ч П Ч 27 Ч 22 Ч 22 Ч 22 Ч 22 Ч 22 Ч 22 Ч 22 Ч 22 Ч 22
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131ч 15 16 17 18 19 20 2-1 22 23 24 25 25
м
к
Фотомодификация 55- и йя-ДНК-мишеней с помощью реагента (I) в комплексах (1)-(И) (1) и (I) • (II) (III)
Номер строки Комплекс3 Условия реакции Ковалентные аддукты, % 6 Щелоче-стабиль-ные продукты, о/ а /о Щелочелабильные продукты, %Г Доля триплекса, а
Г, С экв. реагента (I) буфер X У г х+у + г С7 А8 О24 О22
1 (I) - (И) * • (I) 4 2 Б-1 34 16 15 65 29 11 5 34 0,73
2 (I) • (II) * • (I) 22 2 Б-1 5.5 <5 <5 58 21 <5 <5 57 0,15
3 (I) • (II) * • (I) 4 10 Б-1 26 22 23 71 34 15 7 25 0,91
4 ©•(II) МП 22 10 Б-1 45 10 10 65 31 11 6 34 0,47
5 (1)-(Н) * (1) 4 10 Б-2 28 23 24 75 33 16 6 19 0,94
6 (I) • (И) * ■ (I) 22 10 Б-2 28 25 24 77 40 9 5 18 0,94
7 О)-(II) *-«П) 4 10 Б-1 — 27 — 27 45 30 11 ->
8 «)-(ГО ♦■(III) 22 10 Б-1 — 10 — 10 <5 <5 <5 —
9 (I) • (II) * ■ (III) 4 10 Б-2 <5 33 — 35 43 14 4 —
. 10 О)-(II) * (Ш) 22 10 Б-2 <5 35 — 37 37 10 4 —
11 (I) • (И) • (III) * 4 10 Б-1 — 6 — 6 <5 <5
12 (I) • (И) • (III) * 22 10 В-1 — — — <5. <5 5
13 (I)- (II)- (III) * 4 10 Б-2 — 15 — 15 <5 34
14 (I) • (11) • (III) * 22 10 Б-2 — 15 — 16 <5 37
а Звездочкой обозначена 5'-32Р-меченая цепь.
6 За 100% принята сумма площадей всех пиков на денситограмме. * 1(Ю% — с^мма всех пиков на денситограмме, за исключением исходной мишени.
г О , А , в —основания из аденозин-богатой цепи (II) , О —основание из тимидин-богатой цепи (III). Концентрация цепей (II) и (III) 5-Ю"6 М. Буферы Б-1 и Б-2 как в подписи к табл. 1. а — доля триплекса в комплексе (I) • (II) ■ (I), рассчитанная по формуле а - 2У + Х/Х + У + Ъ.
С1Э 00
туры (ср. строки 1и2, Зи4, 7и8, 11и12втабл. 2), а в буфере Б-2с высокой ионной силой это влияние нивелируется (ср. строки 5и6, 9и10, 13и14в табл. 2).
Низкая ионная сила и комнатная температура оказались настолько неблагоприятными условиями для образования тройного комплекса, что при этом фотомодификация в комплексе (I) • (II)- (III) минимальная (10%) дляцепи( Н),ацепь(Ш) практически вообще не модифицируется (рисунок, 8 и 12; табл. 2, строки 8 к 12).
Следует отметить, что пиримидин-богатая цепь (III) во всех случаях модифицируется слабее пурин-богатой цепи (II). Особенно заметно различие при проведении реакции в буфере Б-1 (рисунок, 7, 8 и 11, 12). Как было показано ранее [ 13], перфторарилазидные реагенты предпочтительнее модифицируют остаток в, находящийся в непосредственной близости от реакционноспособной группы. Очевидно, в случае цепи (III) остаток С22 расположен дальше от фотоактивной группы, чем остаток С в цепи (II).
Среди продуктов ковалентного присоединения были обнаружены щелоче-стабильные продукты (до 45%) и щелочелабильные, расщепляющиеся по модифицированным основаниям при обработке пиперидином. Для пиперидин-лабильных продуктов была определена позиционная направленность фотомодификации. Основными точками модификации цепи (II) в комплексе (I) • (II)- (I) являются основания в7 и С24 (рисунок, 15—18). Это свидетельствует о том, что фотомодификация происходит в комплементарном тройном комплексе, причем одна из цепей реагента (I) располагается параллельно, а другая — антипарал-лельно пурин-богатой цепи (II).
В случае комплекса (I) • (II)- (III) цепь (II) модифицируется в основном по основанию в7 (рисунок, 18—21), а цепь (III) — по основанию С22 (23—26). Следовательно, модификация также происходит в условиях формирования триплекса при параллельном расположении цепи реагента относительно пурин-богатой цепи мишени. Незначительная (<5%) модификация цепи по основанию О24(рисунок, 19—22) свидетельствует, что в ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.