БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 20 * № 1 * 1994
УДК 547.963.057:577.6:544
© 1994 г. А. С. Левина, Д. Р. Табатадзе, В. Ф. Зарытова, М. И. Добриков, В. Н. Горн, Л. М. Халимская "
КОМПЛЕМЕНТАРНО-АДРЕСОВАННАЯ ФОТОМОДИФИКАЦИЯ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ АРИЛАЗИДНЫМИ И ПЕРФТОРАРИЛАЗИДНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
III.* ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ РЕАГЕНТЫ С ФОТОАКТИВНОЙ ГРУППОЙ НА КОНЦЕ ИЛИ ВНУТРИ ЦЕПИ; ТАНДЕМЫ РЕАГЕНТОВ
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск;
' Новосибирский государственный университет
Исследована фотомодификация олигонуклеотидов-мишеней реагентами, содержащими n-азидотетрафторбензамидную группу в разных положениях олигонуклеотидного адреса: на 5'- или З'-концевом фосфате или при С5-атоме остатка дезоксиуридина на 5'-конце или внутри цепи. Показано, что реагенты, несущие фотоактивную группу внутри олигонуклеотидной цепи, способны эффективно модифицировать мишень (50—55% образования ковалентных аддуктов реагента с мишенью). Более эффективными оказались производные олигонуклеотидов с фотоактивной группой на 5'- или З'-конце (70% — образование ковалентных аддуктов).. Модификации предпочтительно (30—40%) подвергается остаток гуанозина мишени, расположенный вблизи перфторарилазидной группы и не вовлеченный в образование дуплекса. При использовании тандема реагентов, комплементарных соседним участкам мишени, модифицируется преимущественно тот же остаток гуанозина, причем степень модификации достигает 80%.
Олигонуклеотидные производные, содержащие арилазидные группы, являются перспективными реагентами для сайт-специфической модификации нуклеиновых кислот, поскольку они обладают высоким квантовым выходом [2]. Однако описанные в литературе арилазидные реагенты действуют с низкой эффективностью [3, 4]. В предыдущих работах [1, 5] мы предложили новые, перфтор-арилазидные олигонуклеотидные реагенты, которые, как было показано, эффективно модифицируют ДНК-мишень в комплементарном дуплексе.
В настоящей работе рассмотрена фотомодификация пентадека- и гексадека-нуклеотидов (I) и (II) реагентами, содержащими гс-азидотетрафторбензамидную группу в разных положениях олигонуклеотида-адреса: на 5'- или З'-концевом фосфате (реагенты (III) (IV) и (V)), при С5-атоме дезоксиуридина на конце (реагент (VII)) или внутри цепи (реагенты (VI) и (VIII)), а также с помощью пар
" Сообщение II см. [I].
В статье используются только олигонуклеотиды дезоксиряда, префикс «d» везде в обозначении олигонуклеотидой опущен.
"Данные получены в работе [5].
ш
реагентов, комплементарных 'соседним участкам мишени (тандемы реагентов (III -j-+ IV) и (III + V)).
5Л TAAGTGGAGTTTGGC (I) 3' ТТСАССТр - R (III)
У R - pCAAACCG (IV) У R - pAAACCG (V)
У TUCACCT (VI)
5' AGAAAGTGAGTGTATC (II)
(VII) (VIII)
У CTTTCACU
У CACUCAC
R — р = (СТру~С0НН(СНг)3ЫН-Р—О
7'
и
HN
0- т
.JL^CH2OCH2CH2NHCO-^ср)1-N;
LJ
<£Ri.b
Все реагенты образуют с мишенями стабильные дуплексы (т. пл. 24—30° С). Поскольку фотомодификацию проводили при температуре 4° С, значительно меньшей температуры плавления, можно полагать, что реагенты находятся в момент реакции в дуплексе с мишенью.
При облучении реакционной смеси светом ртутной лампы в области 303—365 нм во всех случаях образуются продукты ковалентного присоединения к мишени одного реагента (фракция Y) и двух реагентов одновременно (фракция Z) в случае, тандемов (рис. 1—3).
На примере реагента (V) показано, что высокая степень образования ковален-тных аддуктов (65%) достигается уже при 2-кратном избытке реагента по отношению к мишени (табл. 1). Увеличение избытка реагента (V) до 10 эквивалентов повышает степень модификации до 73%. При использован™ тандема реагентов соотношение олигонуклеотидов (III): (V): (I), равное 2:2: 1, дает еще более высокую степень образования ковалентных аддуктов (80%) (табл. 1). Таким образом, использование тандемов позволяет увеличить эффективность модификации мишени.
Как видно из табл. 2, степень модификации 5'- или З'-реагентами (III, IV, V) примерно одинакова (около 70%).
Уменьшение ковалентных сшивок в случае реагента (VI) (55%) по сравнению с реагентами (III) -— (IV) (табл. 2) не может быть связано с тем, что фотоактивная группа присоединена к остатку дезоксиуридина, а не к фосфатной группе | 5]. Более низкая степень модификации реагентом (VI) — следствие того, что модифицируемое основание вовлечено в образование дуплекса. С этим согласуется тот факт, что реагент (III) модифицирует преимущественно основание G9 и в гораздо меньшей степени G7, находящееся также внутри дуплекса [1,5].
Аналогичные результаты были получены при фотомодификации гексадека-нуклеотида (II) с помощью олигонуклеотидных реагентов (VII) и (УШ). В данном случае также наблюдается уменьшение образования ковалентных аддуктов при использовании реагентов (VIII), в котором фотоактивная группа присоединена к остатку дезоксиуридина внутри цели (51%), по сравнению с реагентом (VII), содержащим перфторарилазидную группу на 5'-концевомнуклеозиде(69%) (рис. 3, табл. 2).
Для получения информации о позиционной направленности фото-
12 3 U 5
6 7 8 3
6 6
• А3
Рис. 1. Радиоавтограф продуктов фотомодификации мишени ТААСТСОАСТТТОСС ( I) реагентам (IV, V, VI) до {]. 2. 6) и после (4, 5, 9) обработки пиперидином. 3 и 7 — продукты деградации мишени по остаткам пуринов, 8 — исходная мишень. Полосы X и У совпадают по подвижности с исходной мишенью а продуктам;? присоединения реагента к мишени соответственно
модификации реакционные смеси после облучения обрабатывали пиперидином. При этом, так же как в предыдущих работах [ 1, 5], происходит расщепление мишени по модифицированным сайтам; ковалентные аддукты (Y) расщепляются не полностью, т. е. обнаруживаются щелочестабильные продукты модификации, составляющие 10—12% от радиоактивности дорожки геля (рис. 1—3, табл. 2).
В случае реагентов (III)—(V) и тандемов (III -f- IV) и (III + V) основной точкой модификации мишени (I), приводящей к образованию щелочелабильных продуктов, является гуаниновый остаток G9 (рис. 1, дорожки 4, 5; рис. 2, дорожки 3, 4; табл. 2). При использовании реагента (V) и тандема (III + V) направленность воздействия на остаток G9 усиливаете« (ср. строки 1, 2 и 5 со строками 3 и 6 в табл. 2). Это дополнительно свидетельствует о том, что перфторарилазидная группа предпочтительнее модифицирует остаток гуанозина» не вовлеченный в образование дуплекса.
Если реакционноспособная группа присоединена к остатку дезоксиуридина внутри цепи, как в реагенте (VI), то модифицируются расположенные вблизи нее
1 2
3 4 5 6 7 8 9 Ю 11
l|
1
I
Y
•6 •••• г
Рис. 2. Радиоавтограф продуктов фотомодификацяи мишени TAAGTGGAGTTTGGC (I) с помощью тандемов реагентов (III -f IV) и (III -f V). Дорожки 1, 2 — до обработки пиперидином, остальные дорожки — после обработки пиперидином всей реакционной смеси (3, 4), фракций Z (6, £>), Y (7, 10) и X (8, 11). Первая цифра относится к тандему (III) + (IV), вторая — к тандему (III) + (V). 5 — продукты деградации мишени по остаткам пуринов. Полосы X, Y, Z совпадают по подвижности с исходной мишенью, продуктами присоединения одного реагента и двух реагентов соответственно
1 2 3 Ч 5
10
M/í-
Т
б А А
♦ А
т б
- „ ..Ш1.
Рис. 3. Радиоавтограф продуктов фотомодификации мишени AGAAAGTGAGTGTATC (II) реагентами (VIII) и (VII) до (I, 2) и после (4, 5) обработки пиперидином. 5 — продукты деградации мишени по остаткам пуринов. Полосы X и Y совпадают по подвижности с исходной мишенью и продуктами присоединения реагента к мишени соответственно
основания мишени, причем направленность модификации проявляется менее четко (рис. 1, 9; табл. 2). Такая же закономерность обнаруживается при фото-модификации мишени (II) реагентами (VII) и (VIII). В случае реагента (VII), содержащего фотоактивную группу на 5'-концевом нуклеозидном остатке, основной точкой модификации мишени является основание G10; G8 модифицируется в незначительной степени (рис. 3, J, табл. 2). В то же время под действием реагента (VIII), в котором активная группа находится в середине цепи, основания G8 и G10 модифицируются приблизительно одинаково, причем степень модификации каж-
Таблица I
Степень образования ховалентных адцуктов при фотомодификации мишени (I) TAAGTGGAGTTTGGC реагентами (V) и (III + V) *
Реагент (V) (Ш + V)
Молярное отношение 2 5 10 0,7 + 0,7 2 + 2 5 -Ь 5 10 + 10
реагент/мишень
Ковалентные аддукты, % 65 70 73 65 80 80 80
* Буфер —0,16 М NaCl, 0,02 М КН2Р04, 0,1 мМ EDTA, pH 7,4; концентрация мишени 5 • 10 6 М, температура 4° С.
дого из них заметно меньше, чем остатка G10 при использовании реагента (VII) (рис. 3, 4, табл. 2).
Таким образом, оптимальным из рассмотренных вариантом для направленного воздействия на ДНК-мишени может быть использование реагентов типа (V) и особенно тандема реагентов типа (III + V).
Как было показано в предыдущей работе [ 1], модификация ДНК-мишени арилазидными реагентами включает несколько типов повреждений: скрытую модификацию, не приводящую к образованию ковалентных аддуктов реагент-мишень и проявляющуюся при обработке реакционных смесей пиперидином; ковалентное присоединение адреса к мишени, дающее щелочестабильные и ще-лочелабильные аддукты. Последние при обработке пиперидином расщепляются по модифицированным основаниям; частично при этом образуется продукт, совпадающий по подвижности с исходной мишенью. Это было обнаружено при обработке пиперидином отдельных фракций реакционной смеси, полученных при электрофоретическом разделении продуктов реакции.
Аналогичный анализ был проведен в настоящей работе для тандемов реагентов (III -f IV) и (III + V). После элюции из геля пиперидином обрабатывали отдельно фракции X, Y и Z (см. рис. 2), совпадающие по подвижности соответственно с исходной мишенью, с продуктами ковалентного присоединения к мишени одного и одновременно двух олигонуклеотидных реагентов.
Количество продуктов ковалентного присоединения одного из реагентов составляет " 50% (рис. 2, фракция Y), а обоих реагентов — ~ 30% (рис. 2, фракция
Z).
При анализе фракций X обнаруживается скрытая модификация, за
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.