научная статья по теме КОМПОНЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ГЕНОТИПОВ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ Сельское и лесное хозяйство

Текст научной статьи на тему «КОМПОНЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ГЕНОТИПОВ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ»

АГРОХИМИЯ, 2015, № 1, с. 73-81

УДК 577.121.9:633.11"324":58.036.5

КОМПОНЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ГЕНОТИПОВ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ

© 2015 г. Н.И. Рябчун1, Ю.Е. Колупаев2, А.А. Вайнер2, Т.О. Ястреб2, А.И. Обозный2, А.Н. Четверик1

1 Институт растениеводства им. В.Я. Юрьева Национальной академии аграрных наук Украины 61060 Харьков, Просп. Московский, 142, Украина E-mail: zima012012@gmail.com 2 Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева 62483 Харьков, п/о "Коммунист-1", Украина E-mail: plant_biology@mail.ru

Поступила в редакцию 25.09.2014 г.

Исследовано влияние закаливающей и стрессовой низких температур на активность антиокси-дантных ферментов, содержание сахаров и пролина в проростках сортов озимой мягкой пшеницы (Triticum aeativum L.), различающихся по морозоустойчивости: Лютесценс 329 (высокоморозоустойчивый), Досконала (морозоустойчивый) и Безостая 1 (неморозоустойчивый). После закаливания проростков при 2°С отмечено повышение активности каталазы и гваяколпероксидазы у всех сортов, активность супероксиддисмутазы (СОД) повышалась только у сорта Безостая 1. После промораживания незакаленных и закаленных проростков при температуре -6°С у неморозоустойчивого сорта Безостая 1 происходило снижение активности СОД и каталазы, в то время как у устойчивых сортов активность этих ферментов существенно не изменялась. Активность гваяколпероксидазы после промораживания у незакаленных проростков всех трех сортов повышалась, у закаленных изменялась незначительно. Содержание продукта пероксидного окисления липидов - малонового диальдегида - после закаливания и промораживания было более высоким у неморозоустойчивого сорта. После закаливания происходило накопление сахаров и пролина, более существенное у морозоустойчивых сортов. После промораживания закаленных проростков отмечено повышение содержания пролина у морозоустойчивых сортов, но содержание сахаров не изменялось. Сделано заключение, что защитное действие пролина более существенно на стадии стрессового (повреждающего) охлаждения, в то время как при холодовом закаливании окислительно-восстановительный баланс в клетках растений поддерживается преимущественно за счет ферментативной антиоксидантной системы.

Ключевые слова: антиоксидантная система, генотип, проростки пшеницы Triticum aestivum L., морозоустойчивость.

ВВЕДЕНИЕ

На двух третях земной поверхности растения испытывают влияние отрицательных температур. В связи с этим исследование механизмов морозоустойчивости растений и разработка приемов ее повышения являются важной задачей агроэкологии и фитофизиологии. Известно, что устойчивость к морозу определяется совокупностью признаков на разных уровнях организации растительного организма. Среди них в настоящее время особенно важными считаются способность к сохранению целостности и функциональной активности биомембран, синтезу специфических защитных белков (COR-cold-regulated), дегид-

ринов и др., накоплению низко- и высокомолекулярных криопротекторов [1-3].

Известно, что действие многих стрессоров, в особенности низких температур, вызывает нарушения в функционировании электрон-транспортных систем хлоропластов и митохондрий, что приводит к увеличению вероятности стохастического образования активных форм кислорода (АФК) и возникновению окислительных повреждений [4]. В связи с этим способность противостоять окислительным повреждениям при действии низких температур считается одной из важных составляющих морозоустойчивости растений [5].

Для защиты от окислительного стресса в клетках растений функционирует антиоксидантная

система, состоящая из высоко- (антиоксидантные ферменты) и низкомолекулярных компонентов (аскорбиновая кислота, глутатион, фенольные соединения, антиоксиданты, растворимые в ли-пидах - а-токоферол, Р-каротин и др.) [6].

В последние годы получены сведения о роли в антиоксидантной защите не только "специализированных" антиоксидантов, но и таких соединений как сахара и пролин. В частности, показано, что сахара могут участвовать в перехвате свободных радикалов [7], а также включаться в метаболические пути, приводящие к синтезу восстановителей [8].

Показано, что при определенных величинах рН пролин может прямо реагировать с перокси-дом водорода, гидроксильным радикалом и синг-летным кислородом с образованием стабильных свободных радикалов [9, 10]. Как отдельный механизм антиоксидантного действия пролина рассматривается его способность связывать ионы металлов с переменной валентностью и тем самым ограничивать неферментативные свобод-норадикальные процессы [10]. Также получены сведения о возможности вовлечения пролина в регуляцию экспрессии генов и активности ан-тиоксидантных ферментов [11, 12]. В культурах клеток показано повышение под влиянием экзогенного пролина активности ряда антиоксидант-ных ферментов при действии засоления [13], ионов кадмия [14, 15], агентов окислительного стресса [16]. Эти эффекты могут быть обусловлены шаперонным действием пролина, проявляющимся в его способности предотвращать денатурацию белков и обеспечивать восстановление поврежденных полипептидов [17].

Изменения активности антиоксидантных ферментов при закаливании растений и криострессе интенсивно исследуют в течение двух последних десятилетий [18]. С одной стороны, обнаружена связь между активностью разных форм перок-сидазы [5, 19] и каталазы [20] и морозоустойчивостью сортов озимых злаков, хотя в некоторых исследованиях отмечено ее отсутствие [21]. С другой стороны, получены данные о накоплении сахаров и пролина в условиях гипотермии и связи этих процессов с устойчивостью растений к низким температурам [22, 23]. При этом сахара и пролин традиционно рассматриваются как совместимые осмолиты, предотвращающие чрезмерное обезвоживание клеток при образовании внеклеточного льда [24, 25], а не как соединения, проявляющие прямые и косвенные антиоксидант-ные эффекты. Остается неясным, изменяется ли вклад антиоксидантных ферментов и низкомоле-

кулярных протекторов (в частности, пролина и сахаров) в поддержание клеточного гомеостаза, в т. ч. окислительно-восстановительного баланса, при закаливании и криострессе.

В связи с изложенным целью работы было исследование интенсивности пероксидного окисления липидов (ПОЛ), активности ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддис-мутазы - СОД, каталазы и гваяколпероксидазы) и содержания сахаров и пролина у генотипов озимой мягкой пшеницы (ТгШсит аеэНуит L.) с различной морозоустойчивостью при холо-довом закаливании и действии отрицательных температур.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования использовали 3-12-суточ-ные этиолированные проростки разных сортов пшеницы, различающиеся по морозоустойчивости: Лютесценс 329 (высокоморозоустойчивый), Досконала (морозоустойчивый) и Безостая 1 (неморозоустойчивый). Семена после 30-минутного обеззараживания в 6%-ном растворе пероксида водорода проращивали на очищенной водопроводной воде при температуре 20°С в течение 3 сут. Затем проростки помещали на 7 сут в холодильную камеру Вапйэзз (Нидерланды) для закаливания при температуре 2°С. После этого температуру в камере снижали со скоростью 1°С/ч и подвергали проростки промораживанию при температурах -6 или -9°С в течение 5 ч. Далее температуру в камере повышали со скоростью 1°С/ч до 2°С, затем проростки отращивали 4 сут при температуре 20°С и определяли их выживание. В качестве контроля использовали 4-суточ-ные проростки, не подвергавшиеся закаливанию. Поскольку при низкой температуре развитие проростков замедлялось, 10-суточные закаленные растения соответствовали 4-суточным, выращенным при 20°С.

Для биохимических анализов использовали побеги 4-суточных проростков, выращенных при 20°С (контроль), незакаленных проростков, подвергнутых промораживанию при температуре -6°С (после их постепенного оттаивания в течение 8 ч до достижения температуры 2°С). Также анализировали 10-11-суточные закаленные проростки до и после их промораживания в режиме, описанном выше. При исследовании образцов, подвергнутых промораживанию и оттаиванию, использовали побеги, которые на момент анализа не имели видимых признаков инфильтрации тканей.

Для извлечения ферментов навески побегов (200 мг) гомогенизировали на холоде в 10 мл 0.15 М KNa-фосфатного буфера (pH 7.6) с добавлением ЭДТА (0.1 мМ) и дитиотреитола (1 мМ). Для анализа использовали супернатант после центрифугирования гомогената при 8000 g в течение 10 мин при 4°С [26]. Активность цитозольной СОД (КФ 1.15.1.1) определяли при pH реакционной смеси 7.6, используя метод, основанный на способности фермента конкурировать с нитро-синим тетразолием за супероксидные анионы, образующиеся вследствие аэробного взаимодействия НАДН и феназинметасульфата. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) анализировали при рН реакционной смеси 7.0 по количеству разложившегося пероксида водорода за единицу времени. Активность гваяколпероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли, используя в качестве донора водорода гваякол, в качестве субстрата - пероксид водорода. С помощью KNa-фосфатного буфера рН реакционной смеси доводили до 6.2 [26].

Содержание белка в пробах определяли по Bradford, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [27]. Содержание сухого вещества определяли весовым методом. Количество пролина в проростках определяли по методу Бейтса и соавт. с модификациями, описанными ранее [28]. Содержание сахаров анализировали с использованием антронового реактива [28]. Содержание продуктов ПОЛ (в расчете на малоновый диальдегид - МДА) определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой [29].

Эксперименты проводили в трехкратной биологической повторности. На рисунках и в таблицах приведены средние величины и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У незакаленных 4-суточных проростков конститутивная морозоустойчивость практически не проявлялась: после промораживания при температуре -6°С они полностью погибали. Закаливание вызывало существенное повышение

% 100

80

60

40

20

1

i-

2

3

ш

-6°С

-9°С

Рис. 1. Доля выживших проростков озимой пшеницы после 5

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком