БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 577.29;57.086.088;617.7
КОМПОНЕНТЫ FGF2 СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В ТКАНЯХ ЗАДНЕГО СЕКТОРА ГЛАЗА ВЗРОСЛОГО ТРИТОНА Pleurodeles waltl
© 2014 г. Ю. В. Маркитантова, П. П. Авдонин, Э. Н. Григорян
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: yuliya.mark@gmail.com Поступила в редакцию 15.01.2014 г.
Впервые выявлены компоненты сигнального пути FGF2 в тканях задней стенки нормального и регенерирующего глаза взрослого тритона Pleurodeles waltl. В сетчатке, пигментном эпителии сетчатки и сосудистой оболочке методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) обнаружена экспрессия гена fgf2. Доказана высокая гомология нуклеотидной последовательности мРНК наиболее консервативного участка гена fgf2 тритона P. waltl с ортологами fgf2 других позвоночных. Аминокислотная последовательность белка Fgf2 тритона P. waltl демонстрирует еще большую гомологию с этим ростовым фактором у других позвоночных. В исследуемых тканях глаза с использованием Вестерн-блот-гибридизации обнаружен белок Fgf2 с молекулярной массой 35 кДа. Иммуногистохимически изучена локализация белка Fgf2 и его рецепторов Fgfr в пигментном эпителии, хороиде, центральной и ростовой области сетчатки нативного глаза тритона, соединительной ресничке фоторецепторов. Методами ПЦР в реальном времени и иммуногистохимии обнаружено, что в ранний период после удаления сетчатки (через 4—8 сут) происходят down-регуляция гена fgf2 и снижение интенсивности иммунохимической реакции его белкового продукта (Fgf2) по сравнению с таковыми в том же отделе неоперированного глаза.
DOI: 10.7868/S0002332914040080
Фактор роста фибробластов 2 (Fgf2) относится к суперсемейству белков (Fgfs), обладающих высоким сродством к рецепторам с тирозинки-назной активностью и способных модулировать функциональную активность клеток различных типов. Будучи сигнальным секретируемым белком, оказывающим митогенное действие, Fgf2 играет ключевую роль в контроле процессов развития, стимулирует ангиогенез, ранозаживление. Этот белок способен взаимодействовать с четырьмя типами рецепторов клеточной поверхности, что необходимо для осуществления его регу-ляторной гомеостатической функции. Связывание Fgf2 с компонентами внеклеточного матрикса стабилизирует комплексы фактора роста с соответствующими рецепторами, а также может обеспечивать транслокацию ростового фактора через плазматическую мембрану (Nugent, Iozzo, 2000; Itoh, Ornitz, 2011). Регуляция клеточных процессов происходит опосредованно, в результате серии реакций фосфорилирования компонентов сигнального пути FGF, что приводит к передаче сигнала от рецептора в ядро клетки, либо при непосредственном связывании сигнального белка со своими мишенями. Различия в биологическом действии Fgf2 "за пределами" рецепторов внутри клетки обусловлены участием вторичных мессен-джеров, специфического набора мишеней, факторами микроокружения.
В отношении тканей глаза известно, что функции Fgf2 и других членов этого семейства связаны с участием в морфогенезе, ранозаживлении, поддержании пролиферации, обеспечении клеточной жизнеспособности и предотвращении апо-птоза (Wang et al., 1999; Yamada et al., 2000; Martinez-Morales et al., 2005; Tholozan et al., 2007; Chen et al., 2012). В исследованиях с применением моделей развивающейся сетчатки позвоночных показано, что приобретение нейрального фенотипа клетками ретинального пигментного эпителия (РПЭ) может быть индуцировано через конститутивную активацию медиаторов сигнального пути FGF2, например, митогенактивируемую протеин-киназу (mitogen-activated protein-kinase, MAPK-ки-назу) (Zhao et al., 1997). Выявлена связь Fgf2 с транскрипционным фактором Mitf, контролирующим дифференцировку и функцию РПЭ (Nguyen, Arnheiter, 2000). Об участии Fgf2 в ранозажив-лении тканей глаза свидетельствует обнаружение его мРНК в нейральной сетчатке и РПЭ у крыс, а также существенное усиление экспрессии белка Fgf2 в месте повреждения (Yamamoto et al., 1996).
На разных моделях повреждения сетчатки глаза позвоночных получена информация о нейро-трофической и антиапоптотической функции Fgf2 относительно фоторецепторных клеток (Fak-torovich et al., 1990; Hochmann et al., 2012). Участие белков суперсемейства Fgf, и в частности Fgf2, в эпиморфной регенерации было достовер-
но показано на модели восстановления хрусталика (Del Rio-Tsonis et al, 1997, Hayashi et al, 2008), конечности (Yokoyama, 2008), хвоста (Zhang et al., 2000) у тритона. С помощью экзогенного введения гена fgf2 удалось индуцировать конверсию клеток РПЭ в сетчатку на тех стадиях развития цыпленка, когда этот процесс в естественных условиях уже был блокирован (Park, Hollenberg, 1991). На модели удаления сетчатки у куриного эмбриона выяснено, что в ходе регенерации сетчатки Fgf2 действует через Fgí1,2-рецепторы, стимулируя фосфорилирование Erk (Spence et al., 2007). В системе in vitro с использованием эксплантатов РПЭ шпорцевой лягушки Xenopus laevis с личиночных стадий 47—53 было показано, что присутствие Fgf2 в среде индуцирует трансдиф-ференцировку клеток РПЭ в нейроны и глию (Sakaguchi et al., 1997). Поиск возможности регенерации сетчатки из клеток РПЭ у X. laevis в системе in vivo при воздействии экзогенным Fgf2 также свидетельствует о его стимулирующей функции и активации MAPK (Vergara, Del Rio-Tsonis, 2009).
У взрослых тритонов вида Cynops pyrrhogaster, как и у личинок бесхвостых амфибий и эмбрионов птиц, регуляция процесса регенерации с большой вероятностью осуществляется посредством каскада MEK (mitogen-activated protein-ki-nase (MAPK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK)-kinase), активированным Fgf2 (Susaki, Chiba, 2007). Ингибирование действия Fgf2 в процессе трансдифференцировки посредством разобщения РПЭ и подстилающей его сосудистой оболочки — хороида (предполагаемого источника Fgf2), а также химическими ингибиторами MEK подтвердило участие пути Fgf в процессе конверсии клеток РПЭ (Mitsuda et al., 2005).
Взрослый тритон P. waltlii Michan — один из классических объектов для изучения регенерации сетчатки (Mitashov, 1997; Grigoryan, 2012). Ранее в тканях глаза тритона P. waltl в норме и на относительно поздних стадиях регенерации сетчатки мы показали экспрессию гена fgf2 наряду с генами, кодирующими ряд транскрипционных факторов. Активация экспрессии гена Fgf2 сопровождалась up-регуляцией нейроспецифических генов Pax6, Six3 и подавлением экспрессии генов Otx2, RPE65 на стадии формирования транзитной популяции нейробластов зачатка регенерирующей сетчатки (Авдонин и др., 2008). Однако для тритонов этого вида информация об экспрессии гена Fgf2 в нормальном и регенерирующем глазу оставалась фрагментарной.
Цель работы — изучение характера экспрессии Fgf2 и его рецепторов Fgfr2 в тканях заднего сектора глаза тритона Pl. waltl в нормальном глазу и на стадиях инициации регенерации сетчатки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект изучения — взрослые тритоны P. waltl, разводимые в ИБР РАН. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с биоэтическими правилами РАН и комиссии по биоэтике ИБР РАН. У тритонов после анестезии трикаин-метанесульфанатом (MS 222) (Sigma, США) удаляли сетчатку через разрез на дорсальной стороне глаза методом Стоуна (Stone, 1950) или проводили отслойку сетчатки с использованием микрохирургических приемов, описанных нами ранее (Григорян и др., 1996). Помимо глаз оперированных животных исследовали нативные глаза тритонов того же вида. Для морфологических исследований с помощью рутинных гистологических методов готовили срезы глаз толщиной 7 мкм, взятые у контрольных животных, а также через 4 и 8 сут после операций.
Распределение мРНК гена fgf2 в тканях задней стенки оперированных и нативных глаз изучали с помощью полуколичественного метода ПЦР в кДНК из РПЭ с хороидом, а также кДНК из изолированной нейральной сетчатки. Для получения библиотек кДНК с помощью TRI-реагента (MRC, США) выделяли РНК, которую очищали от примесей геномной ДНК обработкой ферментом DNaseTurbo (Ambion, США). Первую цепь кДНК синтезировали с использованием наборов Omniscript RT Kit (Quiagen, Германия) и High Capacity RNA-to-cDNAKit (Applied Biosystems, США). Для нормирования библиотек кДНК использовали праймеры к генам Gapdh и Ef1a. Праймеры для гена fgf2 тритона P. waltl конструировали на основе нуклеотидных последовательностей для других видов позвоночных, аннотированных в базе данных (Gene Bank) и on-line программы BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/), а праймеры для генов Gapdh и Ef1a — на основе нуклеотидных последовательностей из генома тритона P. waltl. Для конструирования праймеров использовали программы Primer Select (DNASTAR, США), Beacon Designer (PREMIER Biosoft International, США). Для секвенирования ПЦР-фрагменты элюировали из агарозы с помощью набора Gene dean (BIO 101 Inc., США).
Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программ BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/), Lasergene (DNASTAR). ПЦР с праймерами к гену fgf2 проводили на матрицах кДНК из тканей глаза с помощью набора для амплификации (Силекс, Россия), на ампли-фикаторе Mastercycler Personal (Eppendorf, Германия). В качестве маркеров длин фрагментов ДНК использовали GeneRuler (Fermentas, Литва). Уровень экспрессии гена fgf2 оценивали с помощью количественного метода ПЦР в реальном времени. Для контроля эндогенной экспрессии использовали гены Gapdh и Ef1a. Нативные ткани
(сетчатку, пигментный эпителий) и РПЭ с хорои-дом (в совокупности) анализировали после удаления сетчатки на 4-е и 8-е сут. Каждую реакцию проводили 5 раз на амплификаторе (Applied Biosystems 7500), с помощью смеси реагентов с ин-теркалирующим красителем Eva Green компании "Синтол" (Россия). Результаты анализировали с применением программы 7500 System Software (Applied Biosystems). Специфичность реакции оценивали по кривым плавления продуктов реакции, а также подтверждали методом электрофореза в агарозном геле. Для определения относительного уровня экспрессии исследуемого гена использовали метод Пфафла (Pfaffl, 2004). Статистическую обработку данных проводили с помощью прог
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.