ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 2, с. 162-169
УДК 577.113.6:546.82431+578.832.1:578.282
КОМПОЗИТЫ ПЕПТИДО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С НАНОЧАСТИЦАМИ ДИОКСИДА ТИТАНА. ГУ+. ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОКОМПОЗИТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ДНК/ПНК ДУПЛЕКСЫ
© 2015 г. Р. Н. Амирханов*, **, Н. А. Мазуркова***, Н. В. Амирханов*, В. Ф. Зарытова *, #
*ФГБУНИнститут химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН,
630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8 **Новосибирский государственный университет ***Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", пос. Кольцово, Новосибирская обл.
Поступила в редакцию 25.06.2014 г. Принята к печати 06.07.2014 г.
На культуре клеток МБСК, инфицированных вирусом гриппа А человека (подтип Н3№), исследована противовирусная активность нанобиокомпозитов 1Ю2 • PL • ДНК/ПНК, в которых ПНК-фрагмент в виде ДНК/ПНК-гетеродуплекса связан электростатически с полилизином, предварительно иммобилизованным на наночастицах диоксида титана (ТЮ2 • РЦ). Показано, что ТЮ2 • PL • ДНК1/ПНК1-нанобиокомпозит, несущий фрагмент ПИК^, направленный к З'-концу некодирующей области сегмента 5 вирусной РНК (вРНК), специфично и эффективно подавляет репродукцию вируса на 99.8%. Определено, что для нанокомпозита ТЮ2 • PL • ДНК/ПНК 50%-ная цитотоксическая концентрация (ТС50) составляет более 1200 мкг/мл, а 50%-ная эффективная ингибирующая концентрации (1С50) составляет менее 3 мкг/мл. Таким образом, нанобиокомпозиты ТЮ2 • PL • ДНК/ПНК не только способны проникать через клеточные мембраны, но и проявляют высокую специфическую антисенс-активность, не вызывая при этом токсического воздействия на живые клетки.
Ключевые слова: ТЮъ наночастицы, нанокомпозиты, ПНК, сайт-специфическое действие, биологическая активность, вирус гриппа, токсичность.
DOI: 10.7868/S0132342315020025
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы серьезное внимание уделяется созданию фармацевтических препаратов нового поколения на основе фрагментов нуклеиновых кислот. Как правило, для этих целей используют фрагменты РНК, ДНК или их аналоги [2—9]. В последние годы стали популярными малые интерферирующие РНК (siRNA) [10—12]. Все эти соединения способны узнавать определенные последовательности генов или мРНК и блокировать
+Сообщение III см. [1]. Сокращения: IC50 — 50%-ная эффективная концентрация; NI — индекс нейтрализации, выраженный как разность логарифмов титра вируса в клетках в отсутствие нанобиокомпозитов (контроль) и титра вируса в клетках, обработанных нанобиокомпозитами; PL — поли-Х-лизин; SI — индекс селективности, определяемый как отношение величины TC50 к IC50; TC50 — 50%-ная цитотоксическая концентрация; вРНК — вирусная РНК; мРНК — матричная РНК, комплементарная исходной вРНК; кРНК — реп-лицированная РНК-копия, комплементарная вРНК; ПНК — пептидо-нуклеиновая кислота. # Автор для связи (тел.: +7 (383) 363-51-23; факс: +7 (383) 363-51-53; эл. почта: zarytova@niboch.nsc.ru).
их функции в клетке или в составе целого организма.
Особо актуально применение "антисенс-реагентов" для лечения вирусных заболеваний. Известно, например, что наиболее распространенные геномы вируса гриппа А постоянно подвергаются точечным мутациям и рекомбинации сегментов, что приводит к появлению новых штаммов, устойчивых к созданным лекарственным препаратам. Вследствие этого многие ранее используемые препараты становятся не эффективными. При использовании антисенс-технологий в качестве мишеней могут быть специально выбраны наиболее консервативные участки генома вируса гриппа, которые наименее подвержены мутациям.
Одним из перспективных аналогов НК, пригодных для подавления экспрессии генетической информации в клетке, являются пептидные аналоги нуклеиновых кислот — пептидо-нуклеино-вые кислоты (ПНК) [5]. Известно, что ПНК устойчивы к действию клеточных ферментов [13,
14], образуют прочные комплементарные комплексы с ДНК и особенно с РНК [6, 15, 16]. Однако для эффективного воздействия ПНК на НК-мишень необходимо решение проблемы их доставки в клетки [15, 17, 18].
Мы предложили доставлять ПНК в клетки в составе нанокомпозитов ТЮ2-РЬ-ДНК/ПНК, созданных путем электростатической фиксации гибридных дуплексов ДНК/ПНК на ТЮ2-нано-частицы, покрытые полилизином (ТЮ2-РЬ). Было показано, что полученные таким образом ТЮ2 • РЬ • ДНК/ПНК-нанокомпозиты проникают в эукариотические клетки и доставляют ПНК без использования трансфицирующих агентов и физических методов воздействия [19].
Важно отметить, что прочность удерживания иммобилизованных ДНК/ПНК-дуплексов в созданных нанокомпозитах может регулироваться путем изменения протяженности перекрывания комплементарных пар гетероциклических оснований. Обратимое присоединение ПНК в виде ДНК/ПНК-гетеродуплексов позволяет ПНК отделяться от нанокомпозита и становиться доступной для взаимодействия с НК-мишенью в клетке [1, 20]. Выявленные возможности созданных на-нокомпозитов требуют их подтверждения в отношении клеточных систем. Необходимо было выяснить, способны ли ПНК, доставленные в клетки в составе ТЮ2-РЬ-ДНК/ПНК-нанокомпозита, эффективно и селективно взаимодействовать с внутриклеточными НК-мишенями как антисенс-оли-гонуклеотиды.
Целью настоящей работы является исследование способности ПНК, доставленных в клетки в составе ТЮ2 • РЬ • ДНК/ПНК-нанокомпозитов, эффективно и специфично взаимодействовать с внутриклеточными НК-мишенями на примере подавления размножения вируса гриппа А человека (И3М2) в инфицированных клетках МЭСК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор структуры ПНК-регентов для воздействия на геном вируса гриппа А
Известно, что геном вируса гриппа А содержит 8 одноцепочечных РНК-сегментов отрицательной полярности [21]. После заражения клеток вирусом гриппа вирусные РНК (вРНК) транскрибируются в мРНК и реплицируются в комплементарные кРНК положительной полярности [7, 21, 22].
В качестве мишени, как и в случае исследования нанокомпозитов (ТЮ2 • PL • ДНК), содержащих фрагменты ДНК [23], мы выбрали сегмент 5, кодирующий нуклеопротеин (МР), который играет ключевую роль в инкорпорации вирусного генома в клеточные ядра инфицированного орга-
Таблица 1. Структуры ПНК и ДНК-олигомеров, используемых в данной работе
Последовательность ПНК и ДНК Обозначение
N GCAAAAGCAGGGTAGAc ПНК!
N AACTCCATATGCCATc ПНК2
N GCAAAAGCAGGGTAGA-RKKRRQRRR0 nHKj-Tat
5'-CTGCTTTTGCTTTTT-3' ДНК!
5'-TATGGAGTTGATCTTTTT-3' ДНК2
5'-TTGTCTACCCTGCTTTTGCGTT-3' ДНКз
Курсивом латинскими буквами обозначены структура ПНК, N- и С-концы ПНК-цепей соответствуют 5'- и З'-концам ДНК [5]. Tat - 9-звенный пептид RKKRRQRRR.
низма и тем самым, способствует дальнейшей репликации и сборке вирусных частиц [24].
В качестве ПНК-фрагмента для воздействия на геном вируса гриппа А был использован олиго-мер ПНК1, комплементарный З'-некодирующему участку гена МР вируса гриппа А человека (И3М2). В качестве контрольного фрагмента использовали олигомер ПНК2 со случайной последовательностью. Для иммобилизации ПНК1 или ПНК2 на ТЮ2-частицах использовали соответствующие комплементарные ДНК-олигомеры ДНК1 или ДНК2. Последовательности исследованных в данной работе ПНК и ДНК-олигомеров приведены в табл. 1.
Исследуемые ПНК-фрагменты были иммобилизованы в виде комплементарных ДНК/ПНК-дуплексов на TiO2 • PL-наночастицах за счет электростатического взаимодействия между положительно заряженными аминогруппами полилизина в составе TiO2 • PL и отрицательно заряженными фосфатными группами сахаро-фосфатного остова ДНК-фрагментов [19]. ПНК в составе наноком-позитов удерживается за счет комплементарных взаимодействий в дуплексе с ДНК-фрагментом длиной в 10 п.о. Созданный нанокомпозит TiO2 • PL • ДНК1/ПНК1 содержал комплементарный вРНК 16-звенный олигомер ПНК1. В качестве контроля получен нанокомпозит, содержащий олигомер ПНК2, некомплементарный РНК вируса гриппа (рис. 1).
Ранее нами было показано, что данные нано-композиты способны диссоциировать и высвобождать свободную ПНК [1], которая далее может взаимодействовать с НК-мишенью (в нашем случае с вРНК) в клетке и, тем самым, блокировать как транскрипцию, так и репликацию вРНК. Следует отметить, что длина ПНК и структура ДНК/ПНК-гетеродуплекса была выбрана таким образом, чтобы перекрывание комплементарных пар оснований в составе ТЮ2• РЬ«ДНК/ПНК-нанокомпозита было минимальным (10 п.о.,
n = 10 п.о.
+
( TiO
+
nGCAAAAGCAGGGTAGAc 3TTTTTCGTTT TCGTC5'
Нанокомпозит TiO2 •РЬ^ДНК1/ПНК1
nHKj ДНК1
n = 10 п.о. ^
ncaactccatatgccatc
3TTTTTCTAGTTGAGGTAT5'
Нанокомпозит TiO2 ^РЬ^ДНК2/ПНК2
ПНК2 ДНК2
n = 16 п.°. | ПНК1
N С (-) врнк
ngcaaaagcagggtagac
UCGUUUUCGUCCCAUCUAUU
ПНК/РНК-комплементарный комплекс
Рис. 1. Структура нанокомпозитных комплексов ТЮ2 • РЬ • ДНК1/ПНК1 и TiO2 ■ РЬ ■ ДНК2/ПНК2, содержащих 16-звенные ПНК-фрагменты, иммобилизованные в виде гибридных ДНК1/ПНК1- или ДНК2/ПНК2-дуплексов с комплементарной частью длиной в 10 п.о. Нанокомпозит ТЮ2 • РЬ • ДНК2/ПНК2 содержит олигомер ПНК2 со случайной последовательностью, который не образует комплементарного комплекса с вРНК. Значком "минус" обозначены отрицательные заряды межнуклеотидных фосфатов в ДНК; п — число (длина) перекрываемых комплементарных пар оснований в дуплексе.
рис. 1), что способствует более легкому высвобождению ПНК [1]. С другой стороны, длина перекрывания ПНК с комплементарной цепью вРНК максимальна и составляет 16 п.о., что, в свою очередь, обеспечивает прочную связь ПНК с вРНК в клеточной среде (рис. 1).
В качестве контрольного образца, не содержащего 1Ю2-наночастицы, использовали конъюгат nHK1-Tat, содержащий пептидный фрагмент транспортного белка Tat, обеспечивающий доставку молекул ПНК в клетки [9]. Другим контрольным образцом, не содержащим в своем составе ТЮ2-наночастицы, был фрагмент нано-композита — комплекс PL • ДНК1/ПНК1.
Противовирусная активность нанобиокомпозита ТЮ2 • РЬ • ДН^/ПНК!
В табл. 2 приведены показатели противовирусной активности нанокомпозитов и контрольных образцов по отношению к вирусу гриппа А (штамм И3М2) на культуре клеток МЭСК.
Из данных табл. 2 видно, что олигомер ПНКЬ комплементарный вРНК, в составе нанокомпо-зита ТЮ2 • Р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.