ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 275-280
УДК 663.54,578.6,535.371,582.282.23
КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ ОПТИЧЕСКИХ ОБРАЗОВ КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ (ОБЗОР)
© 2015 г. Е. О. Пучков
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской области, 142290
e-mail: puchkov@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Компьютерный анализ оптических образов является одним из вариантов применения компьютерного анализа изображений объектов исследований, регистрируемых оптическими методами. В обзоре рассмотрены литературные и собственные данные компьютерного анализа оптических образов микробиологического происхождения. Сделано заключение о том, что использование этого анализа в микробиологии позволяет ускорить, объективизировать и автоматизировать многие традиционные микробиологические методы, а также открывает новые возможности изучения единичных клеток.
Ключевые слова: компьютерный анализ изображений, жизнеспособность микроорганизмов, идентификация, флуоресцентная микроскопия, внутриклеточная вязкость, доксорубицин, Saccharomy-ces cerevisiae, Penicillium, Listeria.
DOI: 10.7868/S0555109915020178
Часть электромагнитного спектра, которую может воспринимать наше зрение, принято называть оптической, а видимые предметы — оптическими образами. Зрительный анализатор был первым "прибором", позволившим обнаружить существование мира микробов. Как известно, сделал это в конце XVII века Антони ван Левенгук с использованием нехитрого, но остроумного приспособления с одной линзой, которое называют "микроскопом Левенгука". В дальнейшем методы изучения микроорганизмов как оптических образов неоднократно совершенствовались, в том числе, с использованием фотографии. Тем не менее, все визуальные исследования носят субъективный характер и в большинстве случаев проводятся на качественном уровне, а некоторые количественные методы отличаются сравнительно большой трудоемкостью. Более того, визуально невозможно полностью "извлечь" и количественно проанализировать всю разностороннюю информацию, которую несет в себе оптический образ. Это цвет (точнее спектральные свойства) и его пространственное распределение; размеры и форма отдельных частей, их взаимное расположение и количество, а в некоторых случаях — свечение, его интенсивность и спектральные характеристики.
Во второй половине XX века с развитием компьютерной техники был разработан принципиально новый подход к работе с этими видами информации — компьютерный анализ изображений
(computer image analysis). В понятие изображение входят все виды искусственного визуального представления реальных или абстрактных объектов. Оптические образы, зарегистрированные в виде фотографий, являются одним из видов изображений. В качестве примеров других видов изображений, которые используются в научных исследованиях, можно привести изображения, полученные в результате рентгенографии, магниторезонансной и ультразвуковой томографии, поверхностной сканирующей микроскопии. Для более точного указания объекта исследования в дальнейшем изложении вместо общего термина "компьютерный анализ изображений" будет использоваться термин "компьютерный анализ оптических образов".
Цель обзора — рассмотрение возможностей компьютерного анализа оптических образов для решения задач микробиологии, используя литературные и собственные данные.
Компьютерный анализ изображений: принципы и возможности. Объекты микробиологических исследований можно условно разделить на две категории: макроскопические и микроскопические оптические образы. Однако предварительно вкратце остановимся на том, что представляет собой компьютерный анализ изображений в общем виде.
В основе компьютерного анализа лежит математическая обработка изображений, представленных как совокупность цифр. Поэтому исходные "физические" изображения сначала трансформи-
руются в "математические (цифровые) изображения". Осуществляется это либо сразу при получении изображения объекта с помощью цифровых фото- и видеокамер, либо путем "оцифровывания" изображений, полученных другими методами, с помощью цифровых сканеров. Цифровые изображения хранятся в компьютере как совокупность небольших элементов, пикселей, каждый из которых несет цифровую (количественную) информацию о пространственных координатах, цвете и интенсивности света в определенной небольшой области объекта. Эту цифровую информацию компьютер использует для вычислений по специальным алгоритмам. Таким образом, компьютер "работает" с изображениями, в частности с оптическим образами, как с большой математической моделью. В зависимости от поставленной задачи результатом компьютерного анализа изображений может быть как получение количественной информации в виде тех или иных измерений в определенной области объекта, так и внесение изменений в цифровое изображение, то есть его "редактирование" [1—2].
Компьютерные программы для анализа изображений, как правило, разрабатываются для определенных задач. Так, ведущие фирмы производители современных оптических микроскопов («Nikon», Нидерланды, "Olympus", Япония, "Leica Microsystems GmbH", Германия) комплектуют их программами корректировки и анализа изображений (например, Nikon ACT-1 for L-1, Olympus Image Analysis Software и Leica Image Analysis Optional Software). Компьютерные счетчики колоний микроорганизмов, которые производятся разными фирмами (например, Sorcerer, "Perceptive Instruments", Великобритания; Clinx Bio-Counter 1200, "Clinx Science Instruments", Китай; КОМ ПАН КОЛ - М1, "Набитех", Россия; Schutt ColonyQuant , "Schut Labortechnik", Германия; ProtoCOL SR, HR, "Synbiosis", США), также оснащаются своим программным обеспечением. Кроме того, существуют программы, которые позволяют осуществлять наиболее распространенные виды анализа любых изображений: измерение оптической плотности или интенсивности свечения, в том числе по красному, зеленому и синему цветам (так называемые "первичные" цвета, из которых компьютер формирует всю цветовую палитру света). С их помощью возможны морфо-метрические измерения линейных размеров и площадей, в том числе объектов сложной конфигурации. Наконец, такие программы позволяют рассчитывать число объектов с заданными показателями и производить статистические расчеты. В качестве примера можно привести коммерческие программы Image-Pro Plus ("Media Cybernetics, Inc.", США) и MetaMorph® ("Molecular Devices, LLC", США), а также доступные в Интер-
нете ImageJ и ImageJ2 (National Institute of Health, США; http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Анализ макроскопических оптических образов.
К категории макроскопических объектов относятся те, которые видны невооруженным глазом. Как правило, это отдельные колонии или пленки микроорганизмов, выращиваемые на плотных питательных средах с использованием чашек Петри. Для исследования таких объектов с помощью компьютерного анализа по их оптическим образам существуют коммерчески доступные компьютерные счетчики/анализаторы колоний микроорганизмов. Основные технические характеристики и исследовательские возможности компьютерных счетчиков/анализаторов колоний микроорганизмов, выпускаемых различными производителями, приведены в работах [3—6].
Подсчет колоний эти устройства могут осуществлять по цифровым изображениям объектов с помощью программ автоматического и визуального счета. В автоматическом режиме независимо от количества колоний на одно изображение затрачивается менее 1 с. Подсчет колоний производится по определенным параметрам, которые задаются оператором. В качестве таких параметров используются оптическая плотность, размер, определенный цвет и/или форма колоний. Главной проблемой при работе в режиме автоматического счета, является наличие конгломератов колоний. Несмотря на имеющиеся в программах многих приборов возможности выделения в конгломератах отдельных колоний, автоматический счет производится с некоторой погрешностью, величина которой зависит от количества "слившихся" колоний. Визуальный счет по изображениям в значительной мере решает проблему конгломерации колоний, и точность учета при этом выше, чем при автоматическом счете. Кроме того, оказалось, что визуальный подсчет по компьютерным изображениям, хотя и уступает по скорости автоматическому, все-таки является более удобным и быстрым по сравнению с традиционным.
Было показано также, что применение компьютерного счетчика колоний может расширить возможности экономичной методики Майлз и Мизра [7]. В оригинальном исполнении эта методика позволяет оценивать способность культуры давать колонии только с точностью до степени разведения (как правило, десятикратного) перед посевом, поскольку оценка производится качественно только по наличию/отсутствию развития микроорганизмов в соответствующем разведении. С помощью компьютерного счетчика единичные микроколонии можно количественно учитывать как в автоматическом, так и визуальном режиме. Это повышает чувствительность ме-
тода до уровня стандартной процедуры с посевом на всю поверхность чашки Петри [5, 8].
Внешний вид колоний служит одним из существенных фенотипических признаков для идентификации всех групп микроорганизмов на разном таксономическом уровне вплоть до штаммов одного вида. Хотя вид колоний при стандартизации условий культивирования не может быть единственным критерием для идентификации, его можно использовать для ряда практических задач, когда требуется ускоренная диагностика культур, например, при скрининговом поиске культур с заданными свойствами, при контроле состояния изолированных культур, при диагностике заболеваний, при санитарно-эпидемиологической экспертизе и т.п. Однако традиционное описание внешнего вида колоний является качественным и субъективным. Компьютерный анализ оптических образов, учитывающий количественные характеристики внешнего вида колоний, можно отнести к одному из инструментов, обеспечивающих реализацию этих целей.
К числу признаков колоний, которые можно количественно описать, относятся цвет [9], его спектральные свойства и распределение по поперечному сечению [6], текстура [9, 10],
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.