ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ ФИЗИЧЕСКАЯ, 2015, том 79, № 2, с. 280-282
УДК 615.076:616-073.582
КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИЗУЧЕНИИ ВЛИЯНИЯ ОРИГИНАЛЬНЫХ ПРО-ФЕРМЕНТНЫХ НАНОГЛИКОКОНЪЮГАТОВ ЭЛЕМЕНТНОГО СЕЛЕНА НА РЕГЕНЕРАЦИЮ ОПОРНЫХ ТКАНЕЙ
© 2015 г. И. А. Шурыгина1, 2, Л. В. Родионова1, М. Г. Шурыгин1, 2, Б. Г. Сухов3, С. В. Кузнецов3, Л. Г. Попова1, Н. Н. Дремина1
E-mail: irinashurygina@gmail.com
Методами конфокальной и флуоресцентной микроскопии изучено воздействие оригинального на-нокомпозита элементного селена и гетерополисахарида арабиногалактана на скорость кальцифи-кации костной мозоли при травматическом повреждении в эксперименте. Установлено, что при локальном повышении концентрации селена в зоне травматического повреждения наблюдается низкая интенсивность минерализации формирующейся костной мозоли, замедление формирования костного регенерата. Обсуждены вопросы сложности визуализации одновременно внесенных флюоресцентных меток.
DOI: 10.7868/S0367676515020271
ВВЕДЕНИЕ
Проблемы нарушения минерализации костной ткани в последние десятилетия приобрели чрезвычайную актуальность в связи с широким распространением остеопороза. При этом остеопороз называют "тихой эпидемией" в связи с длительным латентным течением и проявлением только в виде осложнений. Известно, что минерализация костной ткани во многом определяет ее прочностные свойства.
В настоящее время для оценки скорости минерализации костной ткани применяют различные методы: анализ поперечных срезов методом анализа обратного рассеяния электронов, анализ ра-мановской спектроскопии и фурье- преобразований ИК-микроскопии с использованием прижизненно внесенной тетрациклиновой метки [1], 18Р-фторидов в позитронной эмиссионной томографии [2], флуоресцентную микроскопию костной ткани с прижизненным внесением флуоресцентных меток. В качестве прижизненно внесенных меток, отражающих процесс оссификации, наиболее часто применяется тетрациклин. При этом для оценки динамики процесса, когда необходимо оценить временные сроки отложения солей кальция в костной ткани, однократного вне-
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Иркутск.
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск.
3 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский Институт химии имени А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск.
сения метки недостаточно, и с определенными перерывами либо применяют неоднократное введение тетрациклина, либо чередуют его с другими образующими нерастворимые соединения с ионами кальция веществами. В настоящем исследовании нами изучена возможность одновременного применения двух различных прижизненно вводимых меток для оценки скорости оссифика-ции в зоне перелома. Кроме того, нами изучены возможность визуализации оригинального препарата селена в виде наночастиц в полисахариде арабиногалактане при местном применении и его влияние на оссификацию зоны перелома при травме костной ткани.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез и характеризация нанокомпозита селен(0)-арабиногалактан
В работе использовали специально синтезированный оригинальный нанокомпозит элементного селена и гетерополисахарида арабиногалактана. Синтез композита осуществляли окислением в водном растворе бис(2-фенилэтил)диселенофос-фината натрия перекисью водорода в присутствии арабиногалактана в качестве стабилизирующей матрицы образующихся наночастиц элементного селена(0). Содержание селена в образце нанокомпозита, определенное титриметрическим методом, составило 0.54%. Характеризацию композита проводили методами трансмиссионной электронной микроскопии (исследование проведено с помощью микроскопа ТЕМ-410) и УФ-спектроско-пии (8Ытаё8и ЦУ-1800). Методом оптической
КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ
281
спектроскопии изучена также матрица наноком-позита — арабиногалактан.
Моделирование травматического повреждения
Экспериментальные исследования проведены на двух моделях повреждения костной ткани: модель полного поперечного перелома в верхней трети диафиза бедренной кости с открытым погружным ретроградным интрамедуллярным остеосин-тезом стальным штифтом [3] (крысы самцы линии Wistar, N = 30) и дырчатого перелома большебер-цовой кости (кролики породы Шиншилла, самцы, N = 8, в том числе 5 — с естественным течением ре-паративного процесса (контрольная группа) и 3 — локальное интраоперационное введение в зону перелома препарата наноселена в пересчете на селен — 50.33 мкг/кг (группа "наноселен")).
Эксперимент выполняли в соответствии с нормами гуманного обращения с животными, которые регламентированы "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) согласно протоколу, одобренному Комитетом по биомедицинской этике НЦРВХ СО РАМН.
В качестве маркеров скорости регенерации костной ткани животным всех групп на 7-е и 21-е сутки внутримышечно вводили раствор окситет-рациклина гидрохлорида (ООО "Биохимфарм", ТУ 9344-080-70972578-06) в дозе 250 мг/кг веса тела, а на 14-е и 28-е сутки — раствор ализаринового красного S внутрибрюшинно 100 мг/кг веса тела.
Выведение крыс из эксперимента осуществляли на 3, 5, 9, 14, 21 и 35-е сутки, кроликов — на 35-е сутки внутриплевральным введением раствора тио-пентала натрия в дозе 167 мг/кг.
Фиксацию материала проводили в растворе FineFix (Milestone, Италия).
Декальцинацию и последующую подготовку препаратов костной ткани для гистологического исследования проводили разработанным нами способом [4]. Осуществляли проводку и заливку материала в парафиновые блоки, изготавливали серийные срезы толщиной 7 мкм, депарафиниро-вали срезы и заключали в Fluoromount (Diagnostic Biosystems, REF K024, Lot P 939-B). Визуализацию специфического свечения флуорохромных меток проводили на лазерном конфокальном микроскопе Zeiss LSM-710 и на исследовательском микроскопе Nikon Eclipse 80i с приставкой для эпифлуоресценции DIH-M. В качестве фильтров для выделения требуемых диапазонов флуоресценции использовались Nikon B-2A (возбуждение 450—490 нм, дихроичное зеркало 505 LP, эмиссия >515 нм), Nikon TRITC (возбуждение 528—553 нм, дихроичное зеркало 565 LP, эмиссия 590—650 нм). В качестве регистратора использовали камеру Nikon DS-Fi1c, подключенную к
контроллеру Nikon DS-U2, с использованием программного обеспечения Nikon Elements.
Также осуществляли визуализацию препаратов окситетрациклина гидрохлорида, ализаринового красного S и нанокомпозита элементного селена на арабиногалактане.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор арабиногалактана для синтеза селенового нанокомпозита обусловлен тем, что этот водорастворимый гетерополисахарид уже хорошо зарекомендовал себя как базовый биосовместимый полимер для получения различных нанокомпозит-ных систем биомедицинского назначения [5, 6].
Установлено, что синтезированный наноком-позит элементарного селена и арабиногалактана — это порошок красно-оранжевого цвета, хорошо растворимый в воде. Спектр оптического поглощения арабиногалактана, использованного в качестве матрицы при синтезе нанокомпозита, имеет четко выраженные пики в области 199 и 287 нм, которые можно отнести к остаточным концевым альдегидным группам углеводных звеньев полисахарида. При исследовании спектра оптического поглощения нанокомпозита Se-AG в диапазоне 190—1000 нм регистрировался минимальный подъем (0.005 abs.) в области 926 нм, а также постепенный рост в диапазоне 600—190 нм до 0.772 abs. с небольшими плато в районе 230—221 нм и 204— 197 нм, что характерно для наноселена(0) [7].
При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что композит представлен глобулами арабиногалактана, покрытыми частицами селена, при этом размер отдельных частиц селена составляет всего 2—3 нм.
Установлено, что при исследовании изолированного препарата окситетрациклина гидрохлорида он представлен кристаллами игольчатой формы. При возбуждении лазером с длиной волны 405 нм наблюдается эмиссия в области спектра от 490 до 565, пик приходится на 553 нм.
Раствор ализаринового красного при возбуждении лазером с длиной волны 561 нм имеет эмиссию в диапазоне 570—675 с максимумом 605 нм.
При оценке оссификации в образующейся кости у крыс и кроликов контрольной группы установлено, что наблюдалось интенсивное отложение солей кальция в формирующейся костной мозоли, что отражалось в виде отложения прижизненно введенного окситетрациклина и ализаринового красного. На 35-е сутки после травмы регистрировался костный регенерат, полностью заполняющий зону дефекта кости. Методом эпи-флуоресценции установлено, что зоны отложения обоих маркеров совпадали, при этом применение конфокальной микроскопии на тех же образцах позволило выделить как изолированные
282
ШУРЫГИНА и др.
зоны отложения окситетрациклина или ализаринового красного (накладывающиеся друг на друга в проекции), так и зоны, где оссификация наблюдалась в период введение как ализарина, так и окситетрациклина (симультантное отложение обоих красителей). Таким образом, метод конфокальной микроскопии позволил более четко локализовать зоны отложения окситетрациклина и ализарина.
При изучении нанокомпозита элементного селена и арабиногалактана методом эпифлуорес-ценции установлено, что для изучаемого объекта было характерно свечение во всех изученных областях. При исследовании на конфокальном микроскопе LSM-710 (Zeiss) установлено, что препарат обладает свойствами квантовых точек. Наиболее часто встречающиеся частицы нанокомпозита имели флуоресценцию в широком диапазоне спектра — при возбуждении лазером 405 нм с максимумом излучения 480 нм, 458 нм — максимумом 520 нм, 488 нм — максимумом на 538 нм, 514 нм — максимумом на 555 нм.
Более крупные частицы поглощали только коротковолновое излучение и при возбуждении лазером 405 нм демонстрировали пик эмиссии на 446 нм.
У животных, которым проводили введение на-нокомпозита селена на арабиногалактан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.