ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 430, № 3, с. 409-411
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.57.012.4
КОНФОРМАЦИОННАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА
ПРИОНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА © 2010 г. В. Б. Григорьев, С. Л. Кальнов, А. Н. Покидышев, С. М. Клименко
Представлено академиком Р.М. Хаитовым 09.07.2009 г. Поступило 27.07.2009 г.
Прионные болезни или трансмиссивные губ-кообразные энцефалопатии (ТГЭ) являются особым классом нейродегенеративных болезней, встречающихся как у человека, так и у животных [1]. В основе патогенеза ТГЭ лежит изменение нативной пространственной конформации клеточного белка приона (PrPc), состоящего преимущественно из а-спиралей, в конформацию, обогащенную р-структурами (PrPsc, p-PrP). В процессе развития болезни в ткани мозга как животных, так и человека в большинстве случаев формируются амилоидные фибриллы (так называемые скрепи ассоциированные фибриллы — САФ), состоящие из p-PrP и обладающие частичной устойчивостью к протеолизу. Необходимо отметить, что штаммы прионов, известные на сегодняшний день, существенно различаются инкубационным периодом, клиническими проявлениями индуцированных ими заболеваний, распределением PrPsc в тканях, количеством и типом р-структур в составе PrPsc, конформационной стабильностью, резистентностью к обработке протеиназой К и эпитопами, экспонированными на поверхности PrPsc. В соответствии с "белковой теорией" считается, что такая гетерогенность в вызываемых прионным белком ТГЭ обусловлена различием в пространственной структуре патологенных изо-форм PrPsc [2]. Однако, несмотря на накопленные экспериментальные данные, остаются неясными молекулярные механизмы конверсии PrPc и межвидовой передачи ТГЭ, а также причины штаммовых различий прионных заболеваний. Для понимания этих вопросов в ряде лабораторий [3—6] была осуществлена трансформация ре-комбинантных PrP (рек-PrP) различных видов животных и человека в амилоидные фибриллы. Ранее нами был показан поэтапный процесс фиб-риллизации in vitro С-концевого фрагмента (102— 240 аминокислотный остаток) рекомбинантного PrP крупного рогатого скота (рек-PrP КРС), по-
Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского
Российской академии медицинских наук, Москва
лученного в бактериальной системе экспрессии [7]. В настоящей работе представлены результаты дальнейшего изучения этого процесса, продемонстрировавшие необычную конформацион-ную пластичность рек-РгР КРС.
Раствор очищенного белка рек-РгР КРС (200 мкг/мл) в 0.1 М ацетатном буфере рН 3.7— 4.5, содержащем 2—4 М мочевину или гуанидин-гидрохлорид (ОёпНС1), инкубировали при 37°С и постоянном встряхивании от 1 ч до 7 сут. Кинетику формирования фибрилл определяли при помощи электронной микроскопии, используя метод негативного контрастирования препарата. Изменение содержания р-структур выявляли после обработки образцов протеиназой К и последующим электрофорезом протеазорезистентных полипептидов рек-РгР КРС [7].
После 3 ч инкубации рек-РгР КРС агрегировал в гибкие червеобразные фибриллы диаметром 12 нм, у которых периодичность вдоль длинной оси не выявлялась (рис. 1), а в образцах после 5 ч инкубации было зафиксировано появление ригидных, полиморфных фибрилл на фоне многочисленных червеобразеных фибрилл (рис. 2, 3).
Среди ригидных фибрилл можно было выделить несколько типов структур: одиночные фибриллы диаметром 16 нм и длиной до 240 нм, две
Рис. 1. Электронограмма гибких червеобразных фибрилл.
410
ГРИГОРЬЕВ и др.
Рис. 2. Электронограмма ригидных, полиморфных фибрилл на фоне многочисленных червеобразных фибрилл.
'ч Ч ч:'.'й: ' - 'Н Ё ш
■/х- <
_
200 нм
I_I
Рис. 3. Электронограмма фибрилл, состоящих из двух латерально взаимодействующих одиночных фибрилл. Присутствуют также червеобразные фибриллы.
Г -
200 нм
I_I
Рис. 4. Электронограмма спиральных ригидных фибрилл.
такие фибриллы, перекручиваясь между собой, формировали спираль с периодом 130 нм и длиной до 400 нм; фибриллы, состоящие из двух латерально взаимодействующих одиночных фиб-
рилл (рис. 3); короткие палочкообразные структуры диаметром 7.5—24 нм и длиной 25—80 нм (не показаны); структуры, состоящие из нескольких слоев белка высотой 40—60 нм и длиной 40—100 нм (не показаны). Присутствие червеобразных и ригидных фибрилл сохранялось до конца времени инкубации. Необходимо отметить, что в ряде экспериментов при указанных выше условиях после суток инкубации рек-РгР КРС формировал спиральные ригидные фибриллы, минуя стадию образования червеобразных фибрилл (рис. 4). Червеобразные и ригидные фибриллы обладали частичной устойчивостью к обработке протеиназой К, свойственной САФ.
К настоящему времени формирование червеобразных фибрилл прионным белком было осуществлено только рекомбинантным РгР мыши при температуре 60°С и рН 2.0 [8]. Явление параллельного генерирования червеобразных и ригидных фибрилл рек-РгР продемонстрировано в представленной работе впервые. Процесс полимеризации с образованием червеобразных фибрилл ранее был показан для ряда амилоидоген-ных белков, включая Ар-белок [9], трансферри-тин [10], а-синуклеин [11], а конкурентная фибриллизация червеобразных и регидных фибрилл — только для р2-микроглобулина [12].
В результате анализа полученных и опубликованных данных мы предположили, что процесс формирования фибрилл рек-РгР КРС может идти двумя независимыми путями. Структурной единицей червеобразных фибрилл являются р-оли-гомеры, представляющие собой агрегат молекул белка, подвергшийся конформационной перестройке. Затем эти многочисленные р-олигоме-ры, объединяясь, образуют червеобразные фибриллы по принципу линейной коллоидной полимеризации, что стабилизирует их вторичную структуру [13]. Этот процесс начинается в первые часы инкубации. Самосборка ригидных фибрилл идет, по-видимому, по нуклеационному пути, т.е. начинается с образования зародыша, обогащенного р-структурами, к которому последовательно присоединяются молекулы белка, претерпевая вследствие этого конформационный переход и удлиняя фибриллу [14]. Процесс этот требует длительной лаг-фазы, что и было зафиксировано в наших экспериментах.
Таким образом, полученные данные демонстрируют необычные свойства рек-РгР КРС. В результате спонтанной фибриллизации при низких значениях рН и в присутствии денатурирующих агентов рек-РгР КРС в отличие от наиболее изученных рек-РгР млекопитающих (мыши, хомяка, человека) агрегирует с образованием двух классов фибрилл, которые имеют различную четвертичную структуру и обладают высокой степенью полиморфизма. Выяснение причины этого явления станет предметом дальнейших экспериментов. Обнару-
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 430 № 3 2010
КОНФОРМАЦИОННАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА
411
женная конформационная пластичность рек-PrP КРС частично объясняет возникновение нового штамма прионов, вызывающего атипичную ТГЭ КРС [15], а также расширяет знания о причинах преодоления межвидового барьера при заражении ТГЭ КРС других видов животных и человека.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Prusiner S.B. // Brain Pathol. 1998. V 8. P. 499-513.
2. Aguzzi A. // Nature Cell. Biol. 2004. V. 6. P. 290-292.
3. Bocharova O.V., Breydo L., Parfenov A.S. et al. // J. Mol. Biol. 2005. V. 346. P. 645-659.
4. Morillas M., Vanik D.L., Surewicz W.K. // Biochemistry. 2001. P. 6982-6987.
5. Petty S.A., Adalteinsson T., Decatur S.M. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 4720-4726.
6. LUhrs T., Zahn R., Wuthrich K. // J. Mol. Biol. 2006. V. 357. P. 833-840.
7. Григорьев В.Б., Кальнов С.Л., Покидышев А.Н. и др. // ДАН. 2008. Т. 420. № 2. С. 254-256.
8. Jain S., Udgaonkar J.B. // J. Mol. Biol. 2008. V. 382. P. 1228-1241.
9. Walsh D.M., Lomakin A., Benedek G.B. et al. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 22364-22372.
10. Lashuel H.A., Lai Z.H., Kelly J.W. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 17851-17864.
11. Conway K.A., Harper J.D., Lansbury P. T. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 2552-2563.
12. Kad N.M., Thomson N.H., Smith D. P. et al. // J. Mol. Biol. 2001. V. 313. P. 559-571.
13. Xu S, Bevis B., Arnsdorf M.F. // Biophys. J. 2001. V. 81. P. 446-454.
14. Gosal W.S., Morten I.J., Hewitt E.W. et al. // J. Mol. Biol. 2005. V. 351. P. 850-864.
15. Beringue V., Bensik A., Le Dur A. et al. // PLos Pathogen. 2006. V. 2. P. 0956-0963.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 430 № 3 2010
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.