УДК 577.352
КОНКУРЕНТНЫЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ НАТРИЯ И ПРОТОНОВ В ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОМ КАНАЛЕ Na+,K+-ATP-азы
© 2013 г. В. Ю. Ташкин1, А. А. Щербаков1, Х.-Ю. Апель2, В. С. Соколов1*
Институт электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119991, Москва, Ленинский просп., 31, Россия;
*электронная почта: sokolovvs@mail.ru 2Биологический факультет Университета г. Констанц, 78457Констанц, Германия Поступила в редакцию 14.11.2012 г.
Изучены изменения емкости и проводимости бислойной липидной мембраны с адсорбированными на ней фрагментами мембран, содержащих №+,К+-АТР-азу, вызванные быстрым освобождением протонов из связанного состояния (Са§её-Ы+) под действием вспышки ультрафиолетового света. В присутствии №+,К+-АТР-азы изменения емкости и проводимости зависели от частоты приложенного напряжения, рН и концентрации ионов натрия. Добавление ионов натрия влияло на изменение емкости, вызванное закислением среды при фотолизе Са§её-Ы+, причем величина и знак эффекта натрия зависели от исходного рН. Эти результаты объясняются конкурентным связыванием ионов натрия и протонов в активном центре №+,К+-АТР-азы с цитоплазматической стороны мембраны. Значение рН, при котором эффект ионов натрия меняет знак, позволило определить значение рК центра связывания протонов, равное примерно 7.6.
Ключевые слова: натриевый насос, электрогенный транспорт, №+,К+-АТР-аза, Са§её-Ы+.
DOI: 10.7868/S0233475513020072
Na+,K+-ATP-a3a осуществляет активный транспорт ионов натрия из клетки и калия в клетку за счет энергии гидролиза ATP. Этот белок широко распространен в природе и играет важную роль в функционировании клетки. Механизм активного транспорта ионов №+,К+-АТР-азой установлен в общих чертах: он осуществляется за счет последовательного прохождения нескольких состояний — цикла Алберса-Поста, наиболее существенная особенность которого — наличие двух основных конформаций белка: Е1 и Е2, в которых открыт доступ ионов либо из цитоплазмы, либо из внеклеточной среды к центрам их связывания. Конформационный переход из Е1 в Е2 происходит в результате гидролиза ATP, причем освободившийся фосфат остается связанным с белком (происходит так называемое фосфорилирование). Отщепление фосфата (дефосфорилирование) происходит при обратном переходе из Е2 в Е1. Доступ ионов к центрам связывания осуществляется через "каналы доступа" — колодцы или закрытые с одной стороны ионные каналы [1]. В последние годы получена трехмерная структура №+,К+-АТР-азы в конформации Е2 [2, 3], а также подробные структуры родственной ей Са2+-АТР-азы в нескольких конформациях [4]. Однако структуры каналов доступа остаются не-
изученными, как и ряд вопросов, касающихся механизма функционирования Ма+,К+-АТР-азы.
Существенная информация о строении каналов получена при изучении нестационарного электрогенного транспорта натрия, который происходит в отсутствие ионов калия. Как показали эти исследования, с внеклеточной стороны канал достаточно глубокий, так что в нем падает большая (около 80%) часть приложенного к мембране напряжения, а со стороны цитоплазмы, напротив, неглубокий, и в нем падает малая часть напряжения [5—8]. Основной вклад в электрический ток вносит перемещение в каналах одного из трех ионов натрия. Долгое время оставалось непонятным, почему не удается зарегистрировать заметный электрический ток, связанный с транспортом двух оставшихся ионов. Согласно одной из гипотез [9], связывание этих двух ионов натрия сопровождается депротонированием расположенных вблизи аминокислот, в результате чего вместо переноса заряда (и электрического тока) происходит неэлектрогенный обмен ионов натрия на протоны. В пользу этого предположения говорит тот факт, что эти два места связывания (которые связывают также ионы калия при их транспорте в клетку) гомологичны местам связывания ионов других родственных АТР-аз Р-типа,
NO,
O
"O-S-O- Na+ OCH3 O
Рис. 1. Структурная формула фотоактивируемого донора протонов MNPS (Caged-H+).
которые (Са2+-ЛТР-аза и К+,Н+-ЛТР-аза) осуществляют обменный транспорт ионов металлов на протоны.
Нестационарный электрогенный транспорт ионов Ма+,К+-ЛТР-азой можно изучать в модельной системе, состоящей из бислойной липидной мембраны (БЛМ), на которой адсорбированы содержащие №+,К+-ЛТР-азу фрагменты мембран. Электрические сигналы вызывались быстрым освобождением ЛТР из связанной формы (Caged-ЛТР) под действием вспышки ультрафиолетового света [10, 11]. На этой системе с помощью измерений токов короткого замыкания, а также разработанного нами метода измерений малых приращений адмиттанса (емкости и проводимости) мембраны, вызванных быстрым появлением ЛТР, изучен электрогенный транспорт ионов натрия в обоих каналах доступа Ма+,К+-ЛТР-азы [12]. Недавно мы показали, что вызванные ЛТР приращения адмиттанса происходят даже в средах, не содержащих ионы натрия, и зависят от рН [13]. Эти эксперименты можно объяснить, предположив, что Ма+,К+-ЛТР-аза способна переносить не только ионы натрия, но и протоны. В физиологических условиях протоны обмениваются на ионы натрия без переноса заряда, но при низкой концентрации одних участвующих в нем ионов этот обмен превращается в электрогенный транспорт других ионов: в отсутствие ионов натрия происходит электрогенный транспорт протонов, при высоких значениях рН — натрия. Однако результаты измерений сигналов, вызванных введением ЛТР, не позволяют понять механизм такого транспорта и даже установить, в каком месте цикла Алберса—Поста этот транспорт происходит. Известно, что №+,К+-ЛТР-аза может переносить протоны в отсутствие ионов натрия и калия, гидролизуя ЛТР и осуществляя конформацион-ный переход Е1/Е2 [14, 15]. Поэтому наблюдаемые в эксперименте приращения емкости и проводимости могли быть вызваны электрогенным транспортом ионов как в цитоплазматическом, так и во внеклеточном каналах доступа №+,К+-ЛТР-азы.
Для изучения протонного и натриевого транспорта №+,К+-ЛТР-азой в модельной системе
можно предложить иной подход, чем быстрое фо-тоактивируемое освобождение АТР — быстрое фотоактивируемое высвобождение протонов в результате фотолиза специальных соединений (так называемый Сaged-H+). Закисление среды не должно вызывать переход между конформаци-ями Ма+,К+,АТР-азы — в отсутствие АТР белок находится в Е1-конформации; в присутствии — в Е2. Это позволяет регистрировать электрические сигналы, связанные c транспортом ионов либо только во внутриклеточном канале (при отсутствии в среде АТР), либо только во внеклеточном (когда АТР есть). Соединения, фотолиз которых приводит к закислению среды, были синтезированы и испытаны в нескольких лабораториях [16—18]. В нашей работе эти соединения использовали для изучения электрогенного транспорта ионов в №+,К+-ЛТР-азе на модельной системе БЛМ/адсорбированные мембранные фрагменты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
БЛМ формировали по методу Мюллера-Руди-на в тефлоновой ячейке на отверстии диаметром 1 мм из дифитаноиллецитина (Avanti Polar Lipids, США), растворенного в н-декане. Раствор, применявшийся для исследования №+,К+-АТР-азы, содержал NaCl, концентрация которого варьировалась (см. подписи к рисункам), 0.1 мМ EDTA (acid) и 12 мМ хлорида N-метил-^О-глюкамина (NMG) (Sigma, США). Хлорид NMG был необходим для функционирования хлорсеребряных электродов в отсутствие NaCl. В опытах с прото-нофором использовали пентахлорфенол PCP (ICN, США). Для приготовления растворов использовали следующие реактивы: NaCl, MgCl2 (Merck, Германия), EPPS (Sigma, США), дитио-треитол (Sigma, США). Все растворы готовили на дистиллированной воде, дополнительно очищенной с помощью MILI-Q50 c фильтром Pure PACK-1 (Thermo Scientific).
Фрагменты мембран, содержащие очищенную Na+,K+-ATP-азу в концентрации около 2 мг/мл были выделены из почек кролика по процедуре [19]. Активность Na^K^ATP^bi при 37°C составляла 1300-1700 мкM неорганического фосфата в час на 1 мг белка. Суспензия фрагментов с Na+,K+-ATP-азой хранилась при —6°С в течение нескольких месяцев без существенной потери активности. При проведении измерений суспензию размораживали и хранили при +4°С не более 2 нед.
В экспериментах использовали препарат Сaged-H+ (рис. 1) — MNPS (2-metoxy-nitrophenyl sulfate), синтезированный K. Janko (г. Констанц, Германия). Молекулы этого соединения при поглощении кванта УФ-света выбрасывают в рас-
G, нС
45
40
35
I
%
10 t, мин
Ф, мВ
20
18
16
14
12
10
Рис. 2. Изменения проводимости (1) и мембранного потенциала (2) БЛМ без адсорбированных мембранных фрагментов, вызванные фотолизом MNPS. Состав раствора (мМ): 12 NMG, 10 MgCl2, 10 PCP, pH 7.4. Моменты вспышки света отмечены стрелкой.
твор гидросульфат, который диссоциирует до сульфата, закисляя среду в растворе [18].
В электрических измерениях использовали хлорсеребряные электроды с агаровыми мостиками, заполненными тем же раствором, который находился в ячейке. Для контроля формирования БЛМ, а также в экспериментах с протонофором измеряли емкость, проводимость и потенциал нулевого тока с помощью анализа динамических вольт-амперных характеристик БЛМ, возникающих при подаче на нее периодического переменного напряжения треугольной формы с амплитудой 10—50 мВ и частотой 2—200 Гц. Это напряжение с выхода ЦАП (использовалась плата АЦП/ЦАП L780, Lcard, Россия) подключали к одному из электродов ячейки с БЛМ. Ко второму электроду подключали усилитель КекЫеу-427 (США), выход которого был связан с входом АЦП той же платы. Значения емкости, проводимости и потенциала, соответствующего нулевому постоянному току, вычисляли с помощью программы, разработанной В.С. Соколовым, и их изменения во времени записывали в файл компьютера. При измерении быстрого изменения потенциала БЛМ при фотолизе Caged-H+ использовали электрометрический усилитель КеИЫеу-301, выход которого подавался на АЦП платы L780.
При измерениях изменений емкости и проводимости мембраны, вызванных изменением рН среды при фотолизе Caged-H+, на мембрану подавали периодическое синусоидальное напряжение с амплитудой 50 мВ и частотой 2—1024 Гц. Из-
мерения проводили при комнатной температуре с помощью метода, разработанного ранее для измерения сигналов, вызванны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.