МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 394-404
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА
УДК 577.22;582.32
КОНСЕРВАТИВНЫЕ МОТИВЫ В ПЕРВИЧНЫХ И ВТОРИЧНЫХ СТРУКТУРАХ ГГ81 МХОВ © 2015 г. И. А. Милютина1*, М. С. Игнатов2
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского
Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899 2Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, Москва, 127276
Поступила в редакцию 12.01.2015 г.
Принята к печати 17.01.2015 г.
В нуклеотидных последовательностях ГГ81 мохообразных (изучены 1000 видов мхов из 62 семейств, 11 видов печеночников и один вид антоцеротовых) найдено пять общих высококонсервативных мотивов (КМ1—КМ5), предположительно связанных с процессингом пре-рРНК. Хотя ГГ81 филогенетически отдаленных групп мхов и печеночников существенно различаются по длине и степени дивергенции, консервативные мотивы найдены во всех проанализированных последовательностях. Построены вторичные структуры ГГ81 76 видов мохообразных, найдены основные закономерности расположения в них консервативных мотивов. Показано, что положение сайтов процессинга во вторичной структуре ГГ81 дрожжей Saccharomyces cerevisiae сходно с положением консервативных мотивов во вторичной структуре ГГ81 мхов и печеночников. Рассмотрено также возможное образование шпильки между областью КМ4—КМ5 ГГ81 и высококонсервативным фрагментом 18в рРНК между шпильками 49 и 50 (Н49 и Н50) в предполагаемой вторичной структуре фрагментов пре-рРНК.
Ключевые слова: ITS1, процессинг, вторичная структура, консервативные мотивы, мхи.
CONSERVED SEQUENCE MOTIFS IN PRIMARY AND SECONDARY ITS1 STRUCTURES IN BRYOPHYTES, by I. A. Milyutina1*, M. S. Ignatov2(1Belozersky Institute of Physicochemical Biology, Moscow State University, Moscow, 119899 Russia; *e-mail: iramilyutina@yandex.ru; 2Tsitsin Main Botanical Garden, Russian Academy of Sciences, Moscow 127276 Russia). Using an expanded set of ITS1 sequences of moss (species from 62 Bryophyta families have been studied), 11 hepatica species from five different orders and Anthoceros agrestis we have identified five highly conserved motifs of ITS1 (CM1-CM5), which are presumably involved in the pre-rRNA processing. Despite great variation in sequences as a whole, these motifs remain the same in phylogenetically distant groups of mosses, as well as in A. agrestis and hepatics. We have built models of ITS1 secondary structures for 76 species from all investigated families. The main rules of the conserved motifs location in the secondary structure of ITS1 have been found. The comparison has been drawn between the secondary structures of ITS1 of yeast Saccharomyces cerevisiae and mosses. The comparison demonstrates that the location of processing sites A2 and A3 of yeast is similar to the location of conserved motifs of ITS1 of mosses. The analysis of the secondary structures of RNA transcripts including 3'-end of 18S rRNA and ITS1 of 16 divergent moss species shows complementary links between the conserved region of ITS1 and 18S rRNA located between H49 and H50.
Keywords: ITS1, processing, secondary structure, conserved motifs, bryophyte. DOI: 10.7868/S0026898415030131
Внутренний транскрибируемый спейсер 1 (1Т81) ядерной рДНК находится между генами 188 рРНК и 5.88 рРНК. Универсальность и сравнительно высокая степень дивергенции этого участка генома определяют его использование как маркера при решении задач филогении в различных группах эукариот, как правило, на невысоком таксо-
Принятые сокращения: КМ — консервативный мотив.
* Эл. почта: ташПуиИпа @уап(!ех.ги
номическом уровне — родов или семейств [1—5]. Нуклеотидные последовательности 1Т81 видов из разных семейств обычно сильно дивергированы, так что выровнять их невозможно за исключением наиболее филогенетически молодого порядка гипновых (обсуждение этого случая составит предмет отдельной публикации). Показано, что
1Т81 дрожжей содержит сайты D, А2 и А3 посттранскрипционного процессинга пре-рРНК, необходимые для образования зрелых молекул 178 и 5.88 рРНК [6—11]. Общие функции сильно дивер-гированных последовательностей должны определять наличие консервативных признаков. Единственный крупный таксон, в 1Т81 которого выявлены консервативные мотивы (КМ), — цветковые растения [12]. В некоторых таксонах эука-риот (как правило, не выше семейства) описаны КМ в 1Т81, но они не универсальны [1, 3, 13]. Фрагментарные данные о вторичных структурах и КМ 1Т81 различных эукариот, представляющих, как правило, небольшие таксоны, не дают ответа на вопрос о том, существуют ли какие-либо общие черты организации 1Т81, потенциально связанные с процессингом рРНК.
В настоящей работе в 1Т81 мхов (ВгуорИу1а), группы растений, которая появилась примерно 450 млн лет назад, найдены высококонсервативные мотивы. Сравнительный анализ 1Т81 филогенетически отдаленных мхов показал, что в целом сильно дивергированные нуклеотидные последовательности 1Т81 содержат пять общих КМ (КМ1—КМ5). Эти мотивы найдены также в 1Т81 Anthoceros agrestis (Ап&осегоШрИул) и нескольких видов печеночников (МагсИапИорИуа), включенных в анализ и представляющих два других отдела мохообразных. Мы предполагаем, что найденные КМ могут быть важны для процессинга пре-рРНК. Мы сравнили положение КМ во вторичных структурах 1Т81 цветковых растений [11] и мхов, а также сайтов процессинга во вторичных структурах 1Т81 дрожжей и нашли некоторые общие закономерности локализации консервативных элементов. КМ в 1Т81 мохообразных имеют большое значение для филогенетического анализа, так как позволяют более точно выравнивать дивергированные последовательности. Рассмотрено также возможное образование шпильки между областью КМ4—КМ5 1Т81 и высококонсервативным фрагментом 188 рРНК между шпильками 49 и 50 (Н49 и Н50) в предполагаемой вторичной структуре фрагментов пре-рРНК мхов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Нуклеотидные последовательности ITS1 мхов взяты из GenBank NCBI. Исходно в анализ вошли 4802 последовательности, но после исключения идентичных клонов одного вида, полученных разными авторами, и неполных последовательностей их число сократилось до 1278 (всего 1000 видов из 62 семейств). Изученные семейства относятся к терминальной и базальной кладам филогенети-
ческого дерева. Терминальная клада объединяет мхи с наиболее сложно устроенным перистомом — структурой, ответственной за рассеивание спор и имеющей важное значение для систематики. Для видов терминальной клады характерен двойной перистом с очередным расположением зубцов. Группы с более простым строением перистома занимают на филогенетическом дереве базальное положение. В работу включены также ITS1 11 видов печеночников из пяти порядков и один вид антоцеротовых. Ниже приведен список семейств мхов и порядков печеночников, изученных в работе. BRYOPHYTA: Amblystegiaceae, Anomodontaceae, Aulacomniaceae, Bartramiaceae, Brachytheciaceae, Bryaceae, Callier-gonaceae, Catagoniaceae, Climaciaceae, Cryphae-aceae, Daltoniaceae, Dicranaceae, Disceliaceae, Ditrichaceae, Echinodiaceae, Encalyptaceae, Entodontaceae, Fabroniaceae, Fissidentaceae, Fon-tinalaceae, Funariaceae, Gigaspermaceae, Grimmi-aceae, Helodiaceae, Hookeriaceae, Hylocomiaceae Hypnaceae, Hypopterygiaceae, Lembophyllaceae, Leptodontaceae, Leptostomataceae, Lepyrodontace-ae, Leskeaceae, Leucobryaceae, Leucodontaceae, Meteoriaceae, Miyabeaceae, Mniaceae, Myriniaceae, Neckeraceae, Orthorrhynchiaceae, Orthotrichaceae, Pilotrichaceae, Plagiotheciaceae, Polytrichaceae, Pottiaceae, Prionodontaceae, Pterigynandraceae, Pterobryaceae, Ptychomniaceae, Pylaisiadelphaceae, Rhytidiaceae, Rutenbergiaceae, Saulomataceae, Schimperobryaceae, Sematophyllaceae, Sphagnace-ae, Stereophyllaceae, Takakiaceae, Thuidiaceae, Tim-miaceae, Trachylomataceae. MARCHANTIOPHYTA: Fossombroniales (Fossombronia altilamellosa HM036300), Porellales (Porella densifolia EF545531), Metzgeriales (Aneura maxima DQ986147, Lobatiric-cardia lobata DQ986148), Jungermanniales (Scapa-nia bolanderi EU791767, Lophozia sudetica EU791796, Herbertus sakuraii EU791849, Isopaches decolorans EU791798), Marchantiales (Monoclea gottschei HM776634, Dumortiera hirsuta HM776625, Marchantíapolymorpha AY342318). ANTHOCERO-TOPHYTA: Anthoceros agrestis JQ639079.
Помимо нуклеотидных последовательностей, взятых из GenBank, мы определили последовательности ITS1 двух базальных видов в порядке Hypnales — Acroporium lamprophyllum JQ684532 и Orthorrhynchium elegans (KC995166), ITS1 двух видов из порядка Ptychomniales (Ptychomnion acicu-lare (JQ684530), Garovaglia binsteadii (JQ684531) и A. agrestis (JQ639079) (Anthocerotophyta). ДНК получали с использованием набора Nucleospin Plant Extraction Kit ("Macherey-Nagel", Германия). ПЦР проводили с помощью набора реактивов производства "Диалат ЛТД" (Москва, Россия). Условия ПЦР: начальная денатурация 94°C — 3 мин; 28 циклов: 94°C - 30 с, 58°C - 30 с, 72°C -
30 с; в заключительном цикле продолжительность элонгации 5 мин. Для амплификации ITS1 использовали праймеры itsl (forward) 5'-TCCG-TAGGTGAACCTGCG-3' и its2 (reverse) 5'-GCT-GCGTTCTTCATCGATGC- 3', комплементарные 3'-концу гена 18S рРНК и 5'-концу гена 5.8S рРНК соответственно. Нуклеотидные последовательности ДНК определяли в ЦКП "Геном" с использованием реагентов ABIPRISM® BigDye™ Terminatorv. 3.1 и с последующим анализом продуктов реакции на Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (США).
КМ в ITS1 мхов были обнаружены нами при изучении филогении в порядке Hypnales [5]. В выравнивании ITS1 видов из различных семейств этого порядка наряду с участками неоднозначного выравнивания присутствовали хорошо выровненные участки, содержащие высококонсервативные мотивы. Дальнейший анализ ITS1 мхов из других порядков показал, что пять КМ универсальны и представлены во всех выбранных последовательностях. ITS1 видов из порядка Hypnales выравнивали вручную в программе BioEdit [14], в этой же программе проводили поиск КМ в ITS1 видов из филогенетически более далеких семейств.
Моделирование вторичных структур ITS1 проведено с использован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.