ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 3, с. 319-325
УДК 579.61
КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica, ОБЛАДАЮЩЕГО СПОСОБНОСТЬЮ К ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ ГЕНОМА МИТОХОНДРИЙ
© 2015 г. Е. П. Исакова*, Е. Ю. Эпова**, В. Ю. Секова*, Е. В. Трубникова***, Ю. К. Кудыкина**, М. В. Зылькова**, М. А. Гусева**, Ю. И. Дерябина*
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: elen_iss@mail.ru
**Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, Москва, 142782
e-mail: kudykina_yuliya@mail.ru ***Курский государственный университет, Курск, 305000 Поступила в редакцию 10.11.2014 г.
Ни один из исследованных видов эукариот не обладает системой гомологичной рекомбинации ми-тохондриального генома. Предложен метод искусственного создания такой системы в клетках экс-тремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica с помощью интегративной генетической конструкции pQ-SRUS, предназначенной для введения в их ядерный геном гена RecA из Bacillus subtilis. Адресация рекомбинантного белка RecA в митохондрии обеспечивается за счет лидерных последовательностей мРНК гена SOD2 (5'-UTR и 3'-UTR), обладающих сродством к внешней поверхности митохондрий, и обеспечивающих котрансляционный транспорт RecA внутрь митохондрий. Штамм Y. lipolytica, несущий конструкцию pQ-SRUS, обладает уникальной для живых объектов способностью к интеграции ДНК-конструкций в митохондриальный геном, что было показано с применением тестерной конструкции pQ-NIHN, предназначенной для введения гена EYFP в область инициации трансляции митохондриального гена Y. lipolytica ND1.
Ключевые слова: экстремофильные дрожжи, Yarrowia lipolytica, интеграции ДНК-конструкций в митохондриальный геном, "митохондриальные" рекомбинантные продуценты.
DOI: 10.7868/S0555109915030095
Митохондрии эукариотической клетки имеют аппарат транскрипции, трансляции и контроля фолдинга/деградации белков прокариотического типа. Это свойство митохондрий может быть использовано для получения "митохондриальных" рекомбинантных продуцентов на базе эукариот. Получение целевых белков у этих продуцентов основано на принципах генной инженерии, зарекомендовавших себя на моделях бактерий. Особенно перспективным этот подход является в отношении белков, обладающих дегронами — М-концевыми последовательностями, распознаваемыми протео-сомами, вызывающими немедленный протеолиз продукта. К категории белков с дегронами относится большая часть практически важных белков, необходимых для создания лекарств, диагностических средств, аналитических тест-систем и иммунобиологических препаратов. Таким образом, возможность создания "митохондриальных" продуцентов позволяет существенно расширить номенклатуру белков, пригодных для наработки в клетках эукариот, в частности, дрожжей. Однако создание рекомбинантных эукариотических про-
дуцентов "митохондриального" типа до настоящего времени не реализовано нигде в мире, причиной чего является отсутствие систем введения рекомбинантных ДНК в митохондрии.
В настоящее время ни для одного известного биологического вида не описан ферментативный механизм рекомбинации митохондриального генома [1, 2]. Имеются опубликованные данные по-пуляционно-генетических исследований по статистическому анализу последовательностей митохондрий, позволяющие предполагать существование в природе явления рекомбинации генома митохондрий [3—5]. Однако имеющиеся источники не предоставляют точных данных о механизмах и скорости гомологичной рекомбинации в митохондриях [6]. Известны отдельные белки, предположительно, участвующие в этом процессе, например, Ы§ш101 [7]. Однако до настоящего времени не создано ни одной генетической системы, позволяющей направленно изменять митохондри-альный геном какого-либо организма, вводя туда необходимые замены или дополнительные фрагменты [8]. Приведенные данные позволяют утвер-
ждать, что в митохондриях отсутствует наиболее распространенный фермент, ответственный за гомологичную рекомбинацию, типа RecA, встречающийся у всех известных прокариот, и имеющий аналоги у эукариот. Очищенная до гомогенного состояния рекомбиназа RecA способна осуществлять все химические реакции, необходимые для гомологичной рекомбинации ДНК in vitro [9]. Дополнительные белки, например, белок SSB, связывающий одноцепочечную ДНК, могут повышать ее активность, но не являются абсолютно необходимыми для успешного окончания процесса рекомбинации. Поэтому было выдвинуто предположение, что введение бактериального белка RecA в митохондрии эукариот, например, дрожжей Yarrowia lipolytica, позволит осуществить гомологичную рекомбинацию с участием эндогенного генома митохондрий. Решение этой задачи позволит вводить в геном митохондрий дрожжей Y. lipolytica любые желаемые гены с использованием традиционных технологий на основе гомологичных "плеч" — фрагментов ДНК, идентичных участкам эндогенного генома: схемы с участием одного "плеча", находящегося в составе кольцевой ДНК или линейных фрагментов, фланкированных двумя "плечами". Поскольку гены, имеющиеся в митохондриальном геноме Y. lipolytica, входят в состав одного из двух оперонов, транскрибируемых с двух дивергентно расположенных промоторов, введение дополнительных генов в промежутки между эндогенными генами способно обеспечить устойчивую экспрессию трансгенов на уровне, характерном для собственного генома митохондрий, без использования дополнительных промоторов.
В литературе есть примеры генетических конструкций, используемых для введения бактериальных генов RecA и других бактериальных белков, участвующих в гомологичной рекомбинации, в митохондрии эукариот. В статье Пауля c соавт. [10] описано введение гена белка RecA из Escherichia coli в культивируемые клетки человека. При этом с целью адресации белка RecA в митохондрии на его N-конец был искусственно введен пептид MTS. В работе [11] аналогичный подход был использован для введения в митохондрии Arabidopsis thaliana белка SSB из E. coli, связывающего однонитевую ДНК и повышающего эффективность работы RecA. При этом на N-конец белка SSB присоединяли митохондриальный адресный пептид A. thaliana длиной 28 аминокислотных остатков (а. о.) а на С-конец — зеленый флуоресцентный белок GFP. Продукт наблюдали в митохондриях клеток A. thaliana, подвергнутых транзи-торному введению ДНК-конструкции с помощью бомбардировки металлическими микрочастицами. В работе [12] описано введение гена RecA из Mycobacterium tuberculosis в клетки пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для обеспечения
транспортировки его продукта в митохондрии использовался адресный пептид MTS от субъединицы цитохром С-оксидазы CoxIVp. Скорость транспорта белка RecA в митохондрии исследовалась с помощью "белкового интрона" — последовательности белка интеина, введенного центр последовательности RecA.
Описанные примеры доказывают возможность введения белка RecA в митохондрии эукариот и его стабильность в этой среде. Однако они не позволяют оценивать эффективность рекомбинации митохондриального генома с участием искусственно введенного белка RecA. В опубликованных источниках нет сведений о проведении подобных экспериментов с клетками дрожжей Y. lipolyti-ca, которые являются перспективным объектом биотехнологии: хорошо культивируются в аэробных условиях, имеют разработанную систему для проведения генно-инженерных манипуляций. Кроме того, ни в одной из приведенных работ не упоминается об использовании альтернативного принципа адресации белка RecA в митохондрии с использованием специфических некодирующих последовательностей мРНК, имеющих сродство к внешней мембране митохондрий и обеспечивающих котрансляционный транспорт продукта внутрь органеллы. Этот принцип описан в работе [13] применительно к адресации белка ATP6 (компонент дыхательного комплекса V) с использованием некодирующих областей 5'-UTR и 3'-UTP гена митохондриальной железо-марганцевой супероксиддисмутазы SOD2. Однако, работа [13] выполнена с использованием линии клеток человека HeLa, и на клетках дрожжей, в том числе, Y. lipolytica не воспроизводилась.
МЕТОДИКА
Для поддержания штаммов Y. lipolytica использовали минимальную среду, описанную в работе [14].
Конструкцию pQ-SYUS на базе гена желтого флуоресцентного белка EYFP, использованную в качестве контрольной для тестирования функционирования элементов митохондриальной адрес-сации гена SOD2 (5'-UTR и 3'-UTR), получали с применением термостабильной Taq-полимеразы и других ферментов производства "MBI Fermentas" (Литва) по следующей схеме.
1) Фрагмент, содержащий кодирующую область гена EYFP, описанный в работе [15], нарабатывали с помощью ПЦР с праймерами ECFP1 и ECFP2 на матрице плазмидной ДНК pTagYFP-C ("Евроген", Россия, № FP131). Размер продукта 790 п. н.
2) Фрагмент обрабатывали рестриктазами BamHI и BglII и лигировали в вектор pQE30 ("In-vitrogen", США), расщепленный по сайту BamHI.
XmnI (6940) PvuI (6711) \ AmpR
BglI (6461) ■
EcoRI (89)
a
XbaI(5035)
Spel (97)
SOD2 L
Apa I(779) AvrlI (847) BamHI (911) SphI (1202) HpaI (1237)
RecA
pQ-SRUS
7332 bp
NheI (4179)-NaeI (3939) •
AflII (3904)'
AgeI (3834) Ura3 XmaI (3478)
SOD2 R
Acc65I (2561) KpnI (2565) PstI (2604) T0 term from pQE30
StuI (2841)
Рис. 1. Схема функциональных элементов конструкции pQ-SRUS, предназначенной для введения в клетки У. Иро1уИеа белка RecA с последующей адресацией белка в митохондрии за счет последовательностей 5'-иГО и 3'-иГО гена SOD2.
3) Лигазную смесь трансформировали в клетки E. coli TG1^ высевали на агаризованную среду LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Отбирали колонии, обладающие зеленой флуоресценцией при возбуждении светом с длиной волны 380 нм. Полученный на этой стадии вектор получил название pQE-EYFP.
4) Фрагмент, кодирующий 5'-UTR SOD ам-плифицировали с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК Y. lipolytica CLIB122 с праймерами SOD2-1 и SOD2-2: размер продукта 840 п. н. Продукт очищали и подвергали рестрикции по сайтам EcoRI и BamHI. Полученный фрагмент лигиро-вали с ДНК вектора pQE-EYFP, линеаризованного по сайтам EcoRI и BamHI, и трансформировали в E. coli TG1, отбирали колонии бел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.