МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 654-662
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 577
КОНСТРУИРОВАНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ - АНАЛОГИ БЕЛКА КАРКАСНОЙ НИТИ ПАУТИНЫ СПИДРОИНА 1, И ИХ ЭКСПРЕССИЯ В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
© 2003 г. Э. С. Пирузян*, В. Г. Богуш1, К. В. Сидорук1, И. В. Голденкова,
К. А. Мусийчук, В. Г. Дебабов1
Институт общей генетики им. Н И. Вавилова Российской академии наук, Москва, 119991 Федеральное государственное унитарное предприятие "ГосНИИгенетика", Москва, 113545
Поступила в редакцию 21.02.2003 г.
Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие рекомбинантные белки - аналоги белка каркасной нити паутины спидроина 1. На основе полученных ранее искусственных генов 1f5 и 1f9, кодирующих аналоги спидроина 1, сконструированы гибридные гены, в которых к 3'-концевой части генов искусственных спидроинов в одной рамке считывания присоединен ген репортерного белка лихеназы. В качестве регуляторных элементов использованы слабый конститутивный промотор из области Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens Tr2' и сильный конститутивный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты 35S CaMV. Сконструированные экспрессионные кассеты с помощью трансформации введены в агробактерии, а затем методом листовых дисков - в растения табака. С помощью гибридизации по Саузерну показано, что во всех линиях трансгенных растений произошла встройка по одной копии химерного гена, а размеры встроенных генов соответствуют размерам сконструированных синтетических генов. Из листьев трансгенных растений выделены белковые экстракты и с помощью метода зимограмм и вестерн-гибридизации показано наличие полноразмерных гибридных белков. Результаты свидетельствуют о том, что растения способны поддерживать в своем геноме и экспрессировать синтетические гены белков паутины и являются, таким образом, подходящими продуцентами рекомбинантных аналогов белков шелка паутины.
Ключевые слова: паутина, каркасная нить, спидроин, лихеназа, химерные гены, табак, трансгенные растения.
Изучение взаимоотношений структуры и функций фибриллярных белков является одной из важных проблем современной молекулярной биологии. В настоящее время достаточно полно изучены основные типы атомных структур глобулярных белков, тогда как структуры фибриллярных белков известны лишь приблизительно.
Белки шелка паутины (и, в первую очередь, белки каркасной нити - спидроины), являясь типичными представителями фибриллярных белков, могут служить удобными моделями для изучения взаимосвязи между структурой и функциями у этого типа белков. Преимущества при использовании этих белков в качестве модели определяются следующими обстоятельствами: во-первых, белки паутины имеют строго периодическую структуру [1], что позволяет получать синтетические аналоги их генов путем синтеза повторяющегося элемента с последующей его мультимеризацией; во-вторых, имеется целое семейство родственных белков паутины из разных пауков, отличающихся структурой составляю-
* Эл. почта: eleopiru@vigg.ru
щих их модулей [2-4]. Поэтому, зная о различиях в механо-химических свойствах этих белков, можно судить о роли тех или иных особенностей структуры в обеспечении этих свойств. Меняя последовательности исходных модулей и следя затем за изменениями механо-химических свойств соответствующих фибрилл или пленок, можно моделировать структурно-функциональные взаимоотношения белков этого типа.
С другой стороны, благодаря своим структурным особенностям, белки паутины являются уникальным биоматериалом, сочетающим в себе удивительную прочность и эластичность [5, 6]. Разработка искусственных белков - аналогов белков паутины с заранее заданными свойствами позволит в дальнейшем создавать на их основе материалы с различным сочетанием прочности и эластичности.
В связи с этим ряд исследователей попытались получить генно-инженерные аналоги белков паутины. Использование для этих целей бактерий в качестве хозяев не привело, однако, к существенным успехам: выход целевого продукта был невелик, синтезировать белки размером более 1000
аминокислотных остатков оказалось невозможным, в связи с преждевременной терминацией трансляции (1 событие на 300-1000 кодонов), клонированные гены были нестабильны, что обусловлено их периодической природой [7, 8]. Несколько лучшие показатели достигнуты в случае использования дрожжей Pichia pastoris [9]. Однако в этом случае успех ограничивала проблема дорогостоящих ферментаций и сложной процедуры выделения искомых белков из клеток-продуцентов.
Большая часть этих проблем отпадает при использовании растений, если рассматривать их в качестве биофабрик для наработки рекомбинант-ных белков. В растениях стабильно поддерживаются протяженные гены с прямыми повторами и эффективно синтезируются большие сложные белки типа фибриллярных. Кроме того, для растений как биофабрик имеется отлаженная технология сбора, хранения и переработки (зерна, семян, клубней) с наработанными в них искомыми белками; производство можно достаточно просто масштабировать для обеспечения крупнотоннажного производства искомых белков; в растениях отсутствуют патогены для человека, такие как вирусы и токсины; и, наконец, разработаны простые и быстрые способы получения трансгенных растений. По расчетам немецких ученых себестоимость производства рекомбинантных фибриллярных белков с помощью трансгенных растений в 6-7 раз ниже, чем с помощью микробиологического синтеза [10].
Исходя из этих соображений, нами предпринята попытка получения трансгенных растений табака, экспрессирующих рекомбинантные белки - аналоги белка каркасной нити паутины спидроина 1 паука Nephila clavipes. В качестве модели использованы полученные нами ранее искусственные гены
1f5 и 1f9, кодирующие аналоги спидроина 1, к которым с 3'-конца в одной рамке считывания присоединен ген репортерного белка лихеназы.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Использовали штамм E. coli XL1-Blue для процедур молекулярного клонирования, штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0, модельные растения табака Nicotiana tabacum cv. Samsun.
Конструирование промежуточных экспресси-онных векторов. Использовали стандартные процедуры молекулярного клонирования и протоколы для ПЦР [11]. Эндонуклеазы рестрикции, Т4 ДНК-лигазу, ДнК-полимеразу I (фрагмент Кле-нова), щелочную фосфатазу использовали согласно рекомендациям фирм-изготовителей ("Prome-ga", США; "Fermentas", Литва).
В качестве искусственного гена, кодирующего аналог гена спидроина 1, использованы полученные нами ранее гены 1f5 и 1f9, в которых к 3'-кон-цевой области тетрамерных (1е4) и октамерных (1е8) форм мономера 1е1 присоединен мономер 1d1 [12]. Соответственно плазмиды, несущие гены 1f5 и 1f9, обозначены как pUC19-1f5 и pUC19-1f9.
Конструирование векторов, содержащих кассеты [Met-1f5-Met-His6-licBM2-stop] и [Met-1f9-Met-His6-licBM2-stop], осуществляли в несколько этапов (рис. 1).
Первоначально ДшёШ-^Ш-фрагменты плаз-мид pUC19-1f5 и pUC19-1f9, содержащие сайт рестрикции EcoRI, заменяли синтетическим адаптером HindIII-BglII (адаптор 1), несущим сайты рестрикции PstI и SpeI, а также ATG-кодон, который будет являться стартовым кодоном для fMеt в рекомбинантных белках.
HindIII PstI SpeI Met BglII
Адаптор 1: 5'-AAGCTTCTGCAGACTAGTAATGAGATCT-3' 3'-TTCGAAGACGTCTGATCAT TACTCTAGA-5'
В качестве источника репортерного гена //сВМ2 использована плазмида рТЁи [13]. BamHI-XbaI-фрагмент плазмиды рТЬи, несущий репор-терный ген //сВМ2, клонировали в плазмиде риС21, предварительно гидролизованной этими же ферментами. Полученная плазмида обозначе-
на как рИС21-Ь. Далее фрагмент BgШ-XbaI плазмиды риС21-Ь заменяли синтетическим адаптером, содержащим стоп-кодон и внутренние сайты SacI и SalGI (адаптор 2), с образованием плазмиды рИС21-Ь-А2.
BamHI Stop SacI SalGI Xbal
Адаптор 2: 5'-GGATCCTAAGAGCTCGTCGACATCTAGA-3'
3'-CCTAGGATTCTCGAGCAGCTGTAGATCT-5'
В результате гидролиза BamHI и частичного pUC21-L-A2 удаляли фрагмент BamHI-NcoIb а на расщепления рестриктазой NcoI из плазмиды его место встраивали адаптор 3, содержащий Met,
pUC19-1f1: HindIII, EcoRI, BglII BamHI, XhoI, XbaI, SmaI
pUC19-1f9: HindIII, EcoRI, BglII
1f9 - BamHI, XhoI, XbaI, SmaI
pUC21-L: BamHI, NcoI-
licBM2
-BglII, XbaI
HindIII + BglII + адаптор 1
HindIII, PstI, SpeI, ATG BglII- 1f5 -BamHI, XhoI, XbaI, SmaI
BamHI + XbaI
HindIII, PstI, SpeI, ATG BglII- 1f9 -BamHI, XhoI, XbaI, SmaI pUC21-L-A2:
BamHI, NcoI
BglII, XbaI
+ адаптор 2
licBM2
Stop
-SacI, SalI, XbaI
BamHI + NcoII
+ адаптор 3
pUC21-L-A2-A3:
BamHI, ATG - 6 x His -ApaI, NcoI- licBM2
Stop
SacI, SalI, XbaI
BamHI + XbaI
pUC21-L-1f5-licBM2:
HindIII, PstI, SpeI, ATG BglII- 1f5 -BamHI, ATG 6 x His
pUC21-L-1f9-licBM2:
HindIII, PstI, SpeI, ATG BglII 1f9
BamHI, ATG
6 x His -ApaI, NcoI- licBM2 Stop
6 x His -ApaI, NcoI- licBM2 Stop
SacI, SalI, XbaI, SmaI
SacI, SalI, XbaI, SmaI
Рис. 1. Схема конструирования гибридных генов, 5'-концевая часть которых представляет собой синтетические гены белков - аналогов спидроина 1, а 3'-концевая - репортерный ген, кодирующий термостабильную лихеназу. Указаны только сайты рестрикции, которые использованы при клонировании. 1e1,1d1 - последовательность мономеров синтетических генов белков шелка паутины, 6 x His - последовательность, кодирующая 6 остатков гистидина, licBM2 -последовательность репортерного гена, кодирующего термостабильную лихеназу, Stop - последовательность стоп-кодона, ATG - стартовый кодон.
His6 и внутренний сайт ApaI, с образованием про- межуточной плазмиды pUC21-L-A2-A3.
BamHI Met (His)6 ApaI NcoI
Адаптор 3: 5'-GGATCCATGCACCACCACCACCACCACGGGCCCACCATGG-3' 3'-CCTAGGTACGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCCGGGTGGTACC-5'
Фрагмент БатН1-ХЬаI плазмид рис 19-1/5 и рИС19-1/9 был заменен фрагментом БатН1-ХЬа1 плазмиды рИС21-Ь-А2-А3, содержащим репортерный ген 1'сБМ2. В результате процедур молекулярного клонирования синтетические гены 1/5 и 1/9 оказались в одной рамке считывания с ре-портерным геном /гсБМ2. Полученные плазмиды обозначены как рИС21-1/5-/гсБМ2 и рИС21-1/9-/гсБМ2.
Конструирование растительных экспрессион-ных векторов. Плазмиды рТг2'-1/5-/гсБМ2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.