КОНЦЕНТРАЦИЯ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И В СУПЕРНАТАНТАХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР У ДЕТЕЙ С ЮВЕНИЛЬНЫМ ИДИОПАТИЧЕСКИМ АРТРИТОМ
Пашнина И. А.1,2, Криволапова И.М.1,2, Козлова Е.С.1, Скоробогатова О. В.1, Тузанкина И. А.1,2
'Отдел клинической иммунологии, Областная детская клиническая больница,; 2Лаборатория иммунологии воспаления, Институт иммунологии и физиологии УрО РАН,
Екатеринбург, Россия
Обследованы 73 ребенка (6-17 лет) с ювенильным идиопатическим артритом и 31 условно здоровый ребенок. У больных с артритом методом ИФА выявлено увеличение концентраций ТОТа, и ^-8 в супернатантах культур клеток периферической крови и ТОТа в сыворотке крови по сравнению со здоровыми детьми. Концентрации в исследо-
ванных группах не различались.
Ключевые слова: цитокины, ювенильный идиопатический артрит
Актуальность. Ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) является одним из наиболее часто встречающихся ревматических заболеваний у детей, это инвалидизирующее заболевание, резко снижающее качество жизни больных [1]. В патогенезе ЮИА значительное место занимают аутоиммунные и аутовоспа-лительные реакции [1]. Для дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний наиболее часто используется определение ау-тоантител. Однако для ЮИА не существует удовлетворительных лабораторных маркеров, в отличие от ревматоидного артрита, развивающегося у взрослых [2, 3]. Кроме того, лабораторные методы, используемые для оценки общей активности воспалительного процесса, такие как определение СОЭ, С-реактивного белка, также не всегда адекватно отражают состояние больных и течение патологического процесса [4]. В связи с этим. остается актуальной разработка алгоритмов диагностики ЮИА и мониторинга течения заболевания. Для этой цели широким кругом исследователей предпринимаются попытки использовать определение цитокинов (ЦК) в различных биологических средах, причем данные методы применяются как для дифференциальной диагностики ЮИА, так и для оценки активности заболевания [5, 6, 7].
Данные об уровне ЦК в периферической крови и других биологических жидкостях при ЮИА весьма противоречивы [5]. Сообщается как об увеличении концентрации провоспа-лительных и о снижении концентрации противовоспалительных цитокинов, так и об отсутствии изменения уровня этих белков. Возможно, часть противоречий обусловлена особенностями различных лабораторных методов, применяемых в, такого рода, работах. Широко известно, что ЦК являются коротко-живущими молекулами [8]. Соответственно, их концентрация в сыворотке крови варьирует в широких пределах, что не позволяет в полной мере использовать результаты таких измерений в клинических целях. Другим подходом является исследование культуральных сред, полученных при инкубации различных клеток (чаще клеток периферической крови) [9], что потенциально может давать более стабильные результаты.
Целью работы явилось сравнительное исследование концентрации ЦК в сыворотке крови и в супернатантах культур клеток цельной крови у детей с ЮИА.
Материал и методы. Обследованы дети и подростки 6-17 лет с ЮИА в стадии активности заболевания (п=73) и условно здоровые дети соответствующего возраста без при-
Тематический выпуск «Российский научный форум на Урале»
577
знаков наличия аутоиммунных заболеваний (контроль, п=31). Забор крови для всех исследований проводился путем пункции локтевой вены в утренние часы строго натощак. Для получения сыворотки кровь забиралась в вакуумные пробирки, содержащие активатор свертывания. Приготовление сыворотки осуществлялось путем центрифугирования при 3000 оборотов/мин в течение 30 минут. Кровь для исследования супернатантов клеточных культур забиралась в вакуумные пробирки, содержащие литиевую соль гепарина в качестве антикоагулянта. Образцы крови разводили глутаминсодержащей средой КРМГ-1640 (Пан-Эко, Россия) в соотношении 1:9, инкубировали по 500 мкл в течение 24 часов (37 °С, 5% СО2). После инкубации разведенную кровь центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин. Супер-натанты клеточных культур (СКК) отбирали (по 400 мкл) с помощью автоматического дозатора и однократно замораживали для последующих лабораторных исследований. Концентрацию ЦК в различных образцах исследовали методом ИФА (Вектор-Бест, Россия). Определены концентрации: интерлейкина-1-бета (ГЬ-1р, нижний предел детекции 1 пг/мл), ре-цепторного антагониста интерлейкина-1-бета (ГЫ-БЛ, нижний предел детекции 10 пг/мл), интерлейкина-8 (ГЬ-8, нижний предел детекции 2 пг/мл), фактора некроза опухоли альфа (ТОТа, нижний предел детекции 1 пг/мл). Статистический анализ данных проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых переменных и критерия Вилкоксона для парных выборок.
Результаты и обсуждение. Исследование различных образцов биологического материала показало, что концентрации всех исследованных ЦК в обеих обследованных группах были выше в СКК, чем в сыворотке крови (табл.). Для концентраций IL-1ß и IL-8 были выявлены значимые различия между различными исследованными образцами, как в контрольной группе, так и у детей с ЮИА.
В обеих обследованных группах медианные значения концентрации IL-1ß и TNFa в сыворотке крови были нулевыми (табл.). Отсутствие определимых уровней этих цитокинов соотносится с данными Kleiner G. и соавторов [10], которые также не обнаружили детектируемых уровней ряда цитокинов, включая IL-1ß, в сыворотке крови здоровых субъектов разного возраста. При сравнении сывороточных концентраций между больными с ЮИА и здоровыми детьми различия выявлены только по концентрации TNFa, которая была выше у больных с артритом (табл.). При исследовании СКК эти различия проявились на более высоком уровне значимости. Кроме того, концентрации IL-1ß и IL-8 в СКК также были выше в группе с ЮИА. Можно заключить, что исследование культуральных жидкостей после инкубации клеток крови более информативно при ЮИА, чем исследование сыворотки крови.
Более высокие концентрации TNFa у больных, как в сыворотке крови, так и в СКК у детей с ЮИА отражают патогенетическую значимость данного ЦК при этом заболевании. Данные литературы в отношении уровня TNFa
Группа Цитокин Сыворотка крови СКК Различия между концентрацией цитокина в сыворотке и в СКК
n Медиана Нижняя квартиль - верхняя квартиль n Медиана Нижняя квартиль - верхняя квартиль
Контроль IL-1ß 13 0,0 0,0-0,0 31 2,0 0,0-8,0 р <0,01
IL1-RA 10 255,0 218,0-333,0 31 508,0 215,0-703,0 р >0,1
IL-8 15 7,0 5,0-10,0 31 84,0 35,0-170,0 р <0,001
TNFa 14 0,0 0,0-0,0 31 0,4 0,0-2,0 р >0,1
ЮИА IL-1ß 29 0,0 0,0-0,0 60 8,0* 0,2-22,0 р <0,01
IL1-RA 17 319,0 234,0-437,0 73 522,0 242,0-901,0 р >0,1
IL-8 23 7,0 6,0-12,0 72 278,0** 65,0-761,0 р <0,001
TNFa 31 0,0* 0,0-4,0 60 3,0*** 1,0-5,0 р >0,1
Примечания: различия с контролем: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
Таблица. Концентрация цитокинов (пг/мл) в сыворотке крови и в супернатантах клеточных культур у детей с ЮИА и в контрольной группе
у пациентов с ЮИА противоречивы. Одни авторы не обнаруживают существенного повышения концентраций ТЫБа при ЮИА [6, 11], другие - указывают на существенное повышение уровня этого ЦК у данной категории пациентов [12, 13]. Одним из весомых аргументов в пользу значимой роли ТЫБа в развитии данного заболевания послужили результаты успешного применения моноклональных антител к ТЫБа у детей с ЮИА [1].
Повышенные концентрации ГЬ-1р и 1Ь-8 в СКК у обследованных нами детей с ЮИА свидетельствуют об участии этих ЦК в развитии данного заболевания. Однако в литературных данных, касающихся концентрации ГЬ-1р и 1Ь-8 при ЮИА, имеются противоречия, как и в случае с ТЫБа. Например, Ш. ёе ^ег с соавторами сообщают о повышении уровня ГЬ-1р в плазме у детей с различными вариантами ювенильно-го артрита [14]. Ь. S. Ои и соавторы, напротив, не выявили увеличения концентрации этого ЦК в сыворотке крови пациентов с ЮИА [11]. Существуют свидетельства повышения концентрации 1Ь-8 при ювенильных артритах [15] и отсутствия таких изменений [16].
Заключение. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что определение ТЫБа, ГЬ-1р и 1Ь-8 при ЮИА более информативно в супернатантах клеточных культур, чем в сыворотке крови. Увеличение концентрации перечисленных ЦК у больных с ЮИА по сравнению со здоровыми детьми свидетельствует об общей тенденции к усилению спонтанной продукции провоспалительных ЦК клетками крови при данном заболевании.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алексеева Е. И., Литвицкий П. Ф. Ювенильный ревматоидный артрит: этиология, патогенез, клиника, алгоритмы диагностики и лечения. Под общ. ред. А. А. Баранова. М.: ВЕДИ, 2007, 368 с.
2. Gibson D. S., Rooney M. E., Finnegan S., et al. Rheumatology. 2012, 51, 423-433.
3. Kasapcopur O., Altun S., Asian M., et al. Annals of the Rheumatic Diseases 2004, 63, 1687-1689.
4. Криволапова И. М., Пашнина И. А., Скоробо-гатова О. В., и др. Вестн. урал. мед. акад. науки 2011, 2/1 (35), 157-158.
5. Федоров Е. С., Салугина С. О., Кузьмина Н. Н. Научно-практическая ревматология 2009, 3, 74-89.
6. Yilmaz M., Kendirli S. G., Altintas D., et al. Clinical Rheumatology 2001, 20, 30-35.
7. De Jager W. Ponsen & Looijen BV 2008, 200.
8. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. Цитокины. СПб, Фолиант, 2008, 552.
9. Коненков В. И., Ракова И. Г., Авдошина В. В., и др. Цитокины и воспаление, 2005, 2, 33-37.
10. Kleiner G., Marcuzzi A., Zanin V., et al. Mediators of Inflammation 2013, Article ID 434010.
11. Ou L. S., See L. C., Wu C. J., et al. Clinical Rheumatology 2002, 21 (1), 52-56.
12. Gorska A., Koval-Bielecka O., Urban M., et al. Central European Journal of Immunology 2008, 33 (4), 216-219.
13. Shahin A., Shaker O., Kamal N., et al. Rheumatol. Int. 2002, 2 (2), 84-88.
14. De Jager W., Hoppenreijs E., Wulffraat N., et al. Ann Rheum. Dis. 2007, 66, 589-598.
15. De Benedrtti M., Pignatti P., Bernassconi S., et al. Rheumatology 1999, 26, 425-431.
16. Mangge H., Kenzian H., Gallistl S., et al. Rheumatology 1995, 3, 211-220.
THE CYTOKINES CONCENTRATION IN SERUM AND CELLS CULTURES SUPERNATANTS IN CHILDREN WITH JUVENILE IDIOPATHIC ARTHRITIS
Pashnina I. A.12, Krivolapova I. M.1,2, Kozlo
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.