ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ НА СВЕРХСШИТОМ ПОЛИСТИРОЛЕ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ВОДАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ
ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ © 2015 г. А. Ю. Уалова, С. Г. Дмитриенко1, С. В. Натчук, В. В. Апяри, Ю. А. Золотов
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, 1, стр. 3 1Е-таИ: dmitrienko@analyt.chem.msu.ru Поступила в редакцию 24.04.2014 г., после доработки 02.09.2014 г.
Изучена возможность применения сверхсшитого полистирола для динамического сорбционного концентрирования (твердофазной экстракции) антибиотиков тетрациклиновой группы (тетрациклина, окситетрациклина, хлортетрациклина и доксициклина) из водных растворов. Оптимизированы условия концентрирования тетрациклинов на микроколонке, заполненной сверхсшитым полистиролом. Соединения десорбировали 2 мл смеси ацетонитрил—метанол и определяли в элюате методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с амперометрическим детектором. Концентрирование позволило снизить пределы обнаружения тетрациклинов в 90—100 раз. Пределы обнаружения равны 0.6 (окситетра-циклин, тетрациклин), 1 (хлортетрациклин) и 2 (доксициклин) нг/мл. Методика применена для анализа модельной смеси на основе речной воды.
Ключевые слова: тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин, доксициклин, твердофазная экстракция, сверхсшитый полистирол, ВЭЖХ.
Б01: 10.7868/80044450215030226
В последнее время большое внимание уделяют разработке методов определения антибиотиков тетрациклиновой группы (ТЦА) в продуктах питания [1] и объектах окружающей среды [2, 3]. Во многом это связано с крупномасштабным применением этих лекарственных препаратов в животноводстве для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, в качестве стимуляторов роста животных, а также для увеличения сроков хранения пищевых продуктов. В объекты окружающей среды ТЦА попадают со смывными водами животноводческих ферм и при сбросе сточных вод фармацевтических заводов. ТЦА обнаружены в сточных водах животноводческих ферм [4—7], больниц и фармацевтических предприятий [8, 9], в муниципальных сточных водах [8, 10], поверхностных [11—17] и подземных [11, 17] водах, а также в почвах [15—17]. Содержание ТЦА в сточных и природных водах разных стран колеблется от 1 до 85 и от 0.04 до 8 мкг/л соответственно [8, 18], а в почве от 4.6 до 199 мкг/кг [17, 18]. Присутствие остаточных количеств ТЦА в водах и почве негативно воздействует на экологический баланс окружающей среды, вызывая развитие устойчивых к антибиотикам микроорганизмов, поэтому
задача обнаружения, идентификации и определения этих соединений является весьма актуальной.
В объектах окружающей среды ТЦА чаще всего определяют методом ВЭЖХ совместно с сульфаниламидами [4—7, 10, 11, 13, 15, 17] и другими ветеринарными антибиотиками [9, 10, 13, 15, 17]. В связи с низким содержанием ТЦА в указанных матрицах определению предшествует обязательная пробоподготовка, для чего в последнее время часто используют твердофазную экстракцию (ТФЭ). В процессе ТФЭ возникают проблемы, связанные с высокой гидрофильностью ТЦА (lgP от—1.25 до —0.54) и их способностью образовывать комплексы с ионами металлов, вследствие чего степени выделения этих соединений на большинстве сорбентах невысоки. Сравнение эффективности 12 коммерчески доступных патронов для ТФЭ показало [13], что максимальные степени выделения ТЦА (67—85%) достигаются на патроне, заполненном полимерным сорбентом Oasis HLB, обладающим одновременно свойствами гидрофильности и липо-фильности (HLB — hydrophilic-lipophilic balance). Этот сорбент чаще всего применяют для концентрирования ТЦА из вод [5—9, 11, 12] и очистки почвенных вытяжек [15, 17]. Важен поиск новых сор-
Таблица 1. Некоторые физико-химические свойства изученных тетрациклинов
Соединение М* Р^а, 1 рКа, 2 рКа, 3 lgP Литература
ТЦ 444 3.2 7.78 9.6 -1.25 [2]
ОТЦ 460 3.2 7.46 8.9 -1.12 [2]
ХТЦ 478 3.3 7.55 9.3 -0.62 [2]
ДЦ 444 3.5 7.7 9.5 -0.54** [15]
* М — молекулярная масса.
** Значение параметра гидрофобности (lg-P) рассчитано с помощью стандартного пакета программ @ACD, Toronto, Canada.
бентов, позволяющих количественно выделять ТЦА из различных объектов.
Сверхсшитые полистиролы обладают рядом достоинств, выгодно отличающих их от других полимерных сорбентов. Уникальная способность сверх-сшитых полистиролов (ССПС) практически одинаково набухать как в полярных, так и в неполярных органических растворителях и воде и затем сохранять приобретенный объем обусловлена жесткостью его ажурной полимерной сетки. Кроме того, эти сорбенты отличаются развитой нанопористой структурой и высокой удельной поверхностью, сочетанием гидрофобности и смачиваемости водой поверхности частиц сорбентов, выраженным сродством к полярным органическим соединениям, высокой химической и механической устойчивостью и хорошей регенерируемостью. С применением сверхсшитых полистиролов разработаны методики сорбционного концентрирования фенолов [19], алифатических аминов [20], фенол-карбоновых кислот [21], метилксантинов [22] и сульфаниламидов [23].
Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности сочетания сорбционного концентрирования тетрациклина (ТЦ), окситетра-циклина (ОТЦ), хлортетрациклина (ХТЦ) и док-сициклина (ДЦ) на микроколонке, заполненной ССПС, с последующим определением этих соединений в элюате методом ВЭЖХ с амперомет-рическим детектированием.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектами исследования служили гидрохлориды тетрациклина и хлортетрациклинина, окси-тетрациклин дигидрат (Acros organics, 99.0%) и доксициклина гидрат (Sigma, > 98.0%). Структурные формулы изученных ТЦА приведены ниже, некоторые физико-химические свойства — в табл. 1.
Ri
I 7
Ro Í- R3 N R2/H =3H ?
OH NH
O
2
ТЦ (Rj = H, R2 = OH, R3 = H), ОТЦ (Rj = H, R2 = OH, R3 = OH), ХТЦ (Rj = Cl, R2 = OH, R3 = H), ДЦ (Rj = H, R2 = H, R3 = OH).
Исходные растворы ТЦА (1 мг/мл) готовили растворением их точных навесок в метаноле. Рабочие растворы соединений готовили разбавлением исходных непосредственно перед использованием. В качестве сорбента использовали ССПС (Диапак П-3, ЗАО "БиоХимМак СТ"). Характеристики пористой структуры ССПС, рассчитанные по изотермам низкотемпературной адсорбции азота, приведены в работе [23].
Спектры поглощения и оптические плотности растворов регистрировали на спектрофотометре СФ-103 (Аквилон, Россия), значения pH контролировали иономером Эксперт 001 (Россия). Сорбцию в динамическом режиме проводили с использованием вакуумной установки для ТФЭ М6, Мани-фолд (Аквилон, Россия). ТЦА концентрировали на микроколонке, заполненной 0.030 г ССПС. Перед использованием колонку последовательно промывали ацетонитрилом и водой. Скорость пропускания раствора через колонку составляла 1.0 мл/мин. Хроматографическую часть работы выполняли на жидкостном хроматографе Цвет-Яуза-04 с амперо-метрическим детектором (Е = 1.2 В, стеклоуглерод-ный электрод). Разделение проводили в обращен-но-фазовом варианте ВЭЖХ. Использовали хрома-тографические колонки Диасфер-110-С16 (150 х х 4.0 мм, 6 мкм), Luna 5u C18(2) (150 х 3.0 мм, 5 мкм) и Gemini 5u C18 (150 х 4.6 мм, 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовали водно-ацетонитриль-ные смеси с добавлением фосфорной кислоты. Пробу объемом 20 мкл вводили с помощью петли дозатора. Расход подвижной фазы 0.4 мл/мин. Дистиллированную воду для приготовления элюента дополнительно очищали с помощью системы
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ
275
Рис. 1. Зависимости степени извлечения ОТЦ на микроколонке, заполненной 0.030 г ССПС, от объемной доли метанола (1), этанола (2) и ацетонитрила (3) (а); степеней извлечения ХТЦ (1), ДЦ (2), ТЦ (3) и ОТЦ (4) от объемной доли метанола (б). V = 25 мл, Стца = 20 мкг/мл, рН ~ 6.
очистки воды МИНроге. Элюент дегазировали в ультразвуковой ванне Вгатзотс 1510R-DTH (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор условий ТФЭ тетрациклинов на ССПС.
При оптимизации условий твердофазной экстракции ТЦА на микроколонке, заполненной ССПС, варьировали массу сорбента, объем анализируемого раствора, концентрацию ТЦА, рН и состав раствора, природу и объем элюента. Для минимизации объема элюента целесообразно использовать микроколонку (10 х 6 мм), заполненную 0.030 г ССПС.
ТЦА обладают амфотерными свойствами, что связано с наличием в их составе основных и кислотных групп (схема). В зависимости от рН они находятся в растворе в виде одной из трех форм: катионной (при рН < рКа1), анионной (при рН > > рКа2) и цвиттер-ионной (рКа1 < рН < рКа). Экспериментальные данные, полученные в работе, указывают на то, что ТЦА сорбируются на ССПС в нейтральной (цвиттер-ионной) или катионной форме. Установлено, что количественная сорбция всех изученных ТЦА (98—100%) из 25 мл водного раствора наблюдается в интервале рН 2—8, в области доминирования этих форм. По аналогии с выводами авторов работы [24] можно предположить, что на ССПС наряду с гидрофобными взаимодействиями реализуются также я-я- и катион—я-взаимодействия я-электронной системы тетрациклинов и их протонированной аминогруппы с я-электронной системой ароматических колец сорбента.
На примере ОТЦ изучено влияние на сорбцию добавок метанола, ацетонитрила и этанола. Эти органические растворители часто используют для
выделения ТЦА из твердых объектов. Как видно из данных, приведенных на рис. 1а, по мере увеличения содержания органического растворителя сорбция ОТЦ на ССПС уменьшается. Диапазоны концентраций органического растворителя, не влияющих на количественное выделение ОТЦ на ССПС, составили 0-5, 0-10 и 0-30 об. % для ацетонитрила, этанола и метанола соответственно. Из рис. 1б видно, что из растворов, содержащих до 30 об. % метанола, достигается количественная сорбция не только ОТЦ, но и остальных ТЦА. Кроме того, на сорбцию ТЦА на ССПС не влияет ЭДТА в интервале концентраций 0.01-0.1 М и буферный раствор Макллвейна. Эти компоненты добавляют в анализируемые растворы для предотвращения ком-плексообразования ТЦА с ионами металлов.
Эффективность сорбционного концентрирования методом ТФЭ в значительной с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.