научная статья по теме КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ БЕЛКОВ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ МИЦЕЛЛЯРНЫМИ ФАЗАМИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ Химия

Текст научной статьи на тему «КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ БЕЛКОВ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ МИЦЕЛЛЯРНЫМИ ФАЗАМИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ»

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2010, том 65, № 12, с. 1244-1249

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 543.2:542.61:611.185.1

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ БЕЛКОВ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ МИЦЕЛЛЯРНЫМИ ФАЗАМИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ

© 2010 г. В. С. Старова, С. А. Куличенко

Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, химический факультет 01601 Украина, Киев, ул. Владимирская, 64 Поступила в редакцию 22.10.2009 г., после доработки 26.01.2010 г.

Исследовано влияние электролита, добавок органических кислот и спиртов на эффективность извлечения овальбумина и казеина в модифицированные мицеллярные фазы додецилсульфата натрия. Найдены оптимальная кислотность и условия концентрирования белков низкотемпературными анионоактивными фазами. Предложены мицеллярно-экстракционные методики извлечения белков с ткани, твердой поверхности и из биологических жидкостей.

Ключевые слова: концентрирование, белки, мицеллярные фазы.

Создание новых эффективных методов обнаружения и определения белков требует совершенствования методик выделения и разделения. Так, при космических, криминалистических и биохимических исследованиях для установления наличия, происхождения, химического состава, структуры и свойств биологических субстратов первоочередной задачей является выделение белков в химически чистом, гомогенном состоянии [1—7]. Как правило, анализу белковых субстратов предшествует многостадийная пробоподготовка: отделение белка от носителя, концентрирование и разделение [1, 2].

При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси, органические растворители и растворы ПАВ [1—3]. Так, при разработке методов обнаружения производных белка на поверхности Марса для их экстракции предложены пропанол [4] и буферная смесь, содержащая неионные поверхностно-активные вещества (ПАВ) Tween-20 и Triton X-100 [5]. Оптимальные методы элюирования и концентрирования белков подбирают при обнаружении микроколичеств белка на тканях и твердых поверхностях в рамках криминалистической экспертизы [6, 7]. Для извлечения белков из биологических жидкостей и животных тканей используют смеси хлороформа с метанолом [8], фенола с муравьиной кислотой [8], а также растворы ПАВ-додецилсульфата натрия (ДДСН) [9] или Triton X-114 [10].

Выделение индивидуальных белков затруднено их лабильностью, многокомпонентностью сложных матриц и малым содержанием в пробе. Эффективные методы экстракции должны обладать возможно малым денатурирующим действием, хорошей сочетаемостью с методами разделения и физико-химическими методами определения, а

также позволять манипулировать с небольшим количеством пробы.

Мицеллярная экстракция фазами неионных ПАВ при температуре помутнения является перспективным методом концентрирования и разделения биологических субстратов и позволяет избирательно извлекать гидрофобные белки из их смесей [11, 12]. При этом достигаются достаточно высокие коэффициенты абсолютного и относительного концентрирования при использовании небольших объемов пробы [13]. Мицеллярная экстракция хорошо сочетается со многими физико-химическими методами определения, в частности с высокоэффективной жидкостной хроматографией [13—16]. Однако неполное извлечение ионных и гидрофильных соединений, а также необходимость нагревания системы ограничивают применение фаз неионных ПАВ для концентрирования лабильных биологических субстратов.

Альтернативой классической мицеллярной экстракции фазами неионных ПАВ выступают низкотемпературные фазовые переходы в растворах ионных ПАВ (ИПАВ) [17, 18]. Реализующееся в таких системах сочетание электростатических и гидрофобных взаимодействий способствует повышению эффективности извлечения белков мицеллярными фазами ионных ПАВ.

Ионоактивные фазы формируют при охлаждении мицеллярных растворов ИПАВ ниже температуры фазообразования (точки Крафта) [19], а также при введении в систему модифицирующих добавок. В качестве модификаторов условий фазообразова-ния и свойств мицеллярных фаз используют органические растворители [19], минеральные кислоты [17, 18], неорганические соли [20, 21] и другие гидротропы [22—24]. Эффективными модификатора-

ми, позволяющими проследить влияние природы и гидрофобности гидротропной добавки на параметры фазообразования в растворах ИПАВ, выступают алифатические и ароматические спирты и кислоты [22, 25]. Совместное присутствие электролита и гидротропа в растворе ионного ПАВ приводит к формированию в системе компактной жидкой фазы, способной эффективно извлекать белковые субстраты [26].

При низкотемпературном мицеллярно-экс-тракционном концентрировании белков перспективны анионные ПАВ, в частности, получивший наибольшее распространение додецилсульфат натрия. Применение ДДСН обеспечивает оптимальный компромисс между растворимостью ПАВ, температурой Крафта, значением ККМ и солюби-лизационной емкостью формирующихся фаз. Фазы на основе ДДСН потенциально способны хорошо сочетаться с методами разделения белков — электрофорезом в полиакриламидном геле или гельфильтрацией на сефадексе [27, 28].

Цель работы — изучение условий и закономерностей мицеллярно-экстракционного концентрирования белков низкотемпературными анионоак-тивными фазами на основе ДДСН в присутствии электролита и модифицирующих добавок карбоно-вых кислот и спиртов. Представлялось также важным оценить возможность применения растворов ДДСН для извлечения белков с тканей, твердой поверхности и из биологических жидкостей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты и аппаратура. Использовали додецилсульфат натрия ("Merck", содержание основного вещества >98.5%). Модифицирующие добавки NaCl, фенола, децилового и октилового спиртов, салициловой кислоты, каприловой и ундекановой кислот имели квалификацию ч. д. а. Рабочие растворы ДДСН и NaCl готовили растворением соответствующих точных навесок в дистиллированной воде, а растворы ароматических и алифатических спиртов и кислот — растворением в 0.5 М растворе ДДСН. Рабочие растворы овальбумина (Mr = 4.3 х х 104 Да, pI = 4.8) готовили растворением соответствующих навесок в воде согласно методике [27]. Растворы казеина (Mr = 7.5—10 х 104 Да, pI = 4.7) готовили растворением точных навесок в 0.05 М растворе ДДСН. Необходимые значения рН устанавливали добавлением 0.1 M растворов HCl и NaOH (фиксанал).

Концентрацию NaCl и фенола в работе выражали в %, а концентрации остальных модификаторов — в М.

Спектры поглощения растворов измеряли на спектрофотометре КФК-3. Кислотность растворов контролировали с помощью рН-метра "рН-340" со стеклянным электродом ЭСЛ-43-07.

Методика эксперимента. Водные растворы ДДСН, содержащие все необходимые компоненты, помещали в калиброванные мерные цилиндры емк. 10 мл, закрепляли в штативе и помещали в водяную баню. Для получения плотной и компактной мицеллярной фазы растворы сначала нагревали выше температуры фазообразования и перемешивали, затем постепенно охлаждали до комнатной температуры. Температуру растворов контролировали термометрами, погруженными в цилиндры и непосредственно в водяную баню. Формирующаяся мицеллярная фаза ДДСН собиралась на дне цилиндра. После полного фазового разделения водную фазу отделяли декантацией.

Распределение овальбумина и казеина контролировали по биуретовой реакции [27] спектрофо-тометрическим методом. Для устранения мешающего влияния компонентов мицеллярно-экс-тракционной системы на аналитический сигнал белка в биуретовой реакции методику модифицировали: полученную после декантации мицелляр-ную фазу разбавляли небольшим количеством дистиллированной воды, переносили в мерную колбу емк. 25 мл, добавляли 5 мл 10%-ного раствора Triton X-100, устанавливали рН 7—8, затем добавляли 5 мл приготовленного согласно [27] биуретового реактива и разбавляли дистиллированной водой до метки. Через 20 мин измеряли оптическую плотность полученного биуретового комплекса белка в кюветах с l = 2 см при 550 нм относительно воды. Содержание белков в мицеллярной фазе определяли по градуировочному графику, построенному с применением растворов овальбумина и казеина с известной концентрацией. Правильность результатов определения белковых субстанций при анализе использованных в работе объектов проверяли методами введено—найдено и добавок. Проверено влияние ряда матричных компонентов на правильность определения белка. Так, жиры молока (3.2%), спирты и карбоновые кислоты при концентрациях <0.01 М на интенсивность окраски биуретового комплекса в предложенных условиях практически не влияют. Погрешность оценки степени извлечения белков в эксперименте не превышала 1%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При охлаждении индивидуальных мицеллярных растворов додецилсульфата натрия ниже точки Крафта (16°С) за счет исчезновения мицеллярной составляющей растворимости формируется неплотная кристаллическая фаза, быстро исчезающая при повышении температуры [20]. Введение в растворы NaCl повышает температуру фазообразования до комнатной и выше. Вследствие высаливающего действия электролита объем образующейся кристаллической фазы возрастает, что негативно сказывается на значениях коэффициента абсолют-

Таблица 1. Степень извлечения (R) овальбумина и казеина фазами на основе ДДСН. (1 мг/мл белка, 0.1 M ДДСН, 6% NaCl, 1% фенол, 0.04 М HSal, 0.02 М RCOOH, ROH, рН 4, V0 = 10 мл)

Система Овальбу-мин Казеин

ДДСН 14 15

ДДСН- NaCl 93 94

ДДСН- -салициловая кислота—NaCl 98 95

ДДСН- -каприловая кислота— NaCl 93 >99

ДДСН- -ундекановая кислота—NaCl >99 >99

ДДСН- -фенол—NaCl >99 94

ДДСН- -октиловый спирт—NaCl >99 98

ДДСН- -дециловый спирт—NaCl >99 >99

^белка, %

ного концентрирования. Добавки гидротропов способны уменьшать объем кристаллического осадка ДДСН и снижать температуру фазообразования [26]. Однако формирующаяся в двухкомпонентной системе ДДСН-модификатор кристаллическая фаза для концентрирования микрокомпонентов мало удобна из-за быстрого растворения при комнатной температуре.

При совместном присутствии гидротропа и электролита в растворах ДДСН в зависимости от концентрационных условий возможно образование двух типов фаз — объемной кристаллической и компактной жидкой высоковязкой фазы. Предварительно было установлено, что в трехкомпонент

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком