ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2013, том 68, № 2, с. 108-112
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ МЕТИЛКСАНТИНОВ НА СВЕРХСШИТОМ ПОЛИСТИРОЛЕ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ © 2013 г. С. Г. Дмитриенко, Е. Ю. Андреева, В. В. Толмачева, Ю. А. Золотов
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, 1, стр. 3 Поступила в редакцию 11.04.2012 г., после доработки 26.06.2012 г.
Изучена возможность применения сверхсшитого полистирола для динамического сорбционного концентрирования (твердофазной экстракции) метилксантинов (кофеина, теофиллина, теобромина, дипрофиллина и пентоксифиллина) из водных растворов. Оптимизированы условия концентрирования: 25 мл раствора (рН ~ 6), скорость пропускания раствора 0.7 мл/мин, микроколонка (25 х 2.7 мм), масса сорбента 0.055 г. Соединения десорбировали 0.5 мл метанола и определяли в элюате методом об-ращенно-фазовой ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием при 280 нм. Предварительным сорбционным концентрированием снижены пределы обнаружения метилксантинов более чем в 30 раз. Пределы обнаружения метилксантинов равны 1 (теофиллин, теобромин), 2 (кофеин, дипро-филлин) и 4 (пентоксифиллин) нг/мл. Методика применена для анализа модельных смесей на основе мочи.
Ключевые слова: кофеин, теофиллин, теобромин, дипрофиллин, пентоксифиллин, сверхсшитый полистирол, определение методом ВЭЖХ.
Б01: 10.7868/80044450213020072
В последнее время большое внимание уделяют разработке методов определения пуриновых алкалоидов метилксантинов (МК) в различных объектах, что обусловлено прежде всего их высокой биологической активностью. Метилксантины широко применяют в качестве лекарственных средств, они оказывают возбуждающее влияние на центральную нервную систему, усиливают сердечную деятельность, расширяют сосуды сердца и мускулатуру бронхов, стимулируют диурез. Теофиллин, теобромин и дипрофиллин широко применяют в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний дыхательных путей, пенток-сифиллин — в качестве средства, улучшающего мозговой кровоток, а кофеин — для повышения психической и физической работоспособности. Кофеин является одним из наиболее широко потребляемых в мире фармакологически активных веществ. Он и его природные метаболиты теофиллин и теобромин попадают в организм человека с напитками, продуктами питания и лекарствами в сравнительно больших количествах [1]. В среднем в мире каждый человек потребляет до 829 мг кофеина в день, что приводит к тому, что его концентрация в плазме крови колеблется от 5 до 20 мкМ [2]. В настоящее время кофеин относят к стимуляторам, применение которых разре-
шено, однако Медицинская комиссия МОК допускает предельную дозу кофеина в моче спортсменов 12 мкг/мл, что предполагает проведение анализа мочи на содержание этого вещества и его метаболитов [3—7].
Информация о концентрациях метаболитов кофеина и других метилксантинов в организме человека — важное звено в построении метаболо-мических профилей [8], позволяющих обнаружить врожденные и наследственные нарушения метаболизма и более точно диагностировать диабет, патологии печени и ряд других заболеваний. По содержанию кофеина и его метаболитов в биологических жидкостях определяют активность изоферментов системы цитохрома р450 (СУР 450), которые катализируют окислительный метаболизм различных химических веществ, включая большинство лекарств [9—13]. Стандартные методики оценки активности ферментов ци-тохрома р450 включают определение кофеина и трех его основных метаболитов в моче, плазме или слюне через определенное время после приема кофеина [14—16].
Согласно литературным данным, систематизированным в обзоре [17], метилксантины в биологических жидкостях определяют методом обра-щенно-фазовой ВЭЖХ в сочетании с УФ- или
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ МЕТИЛКСАНТИНОВ НА СВЕРХСШИТОМ ПОЛИСТИРОЛЕ
109
МС-детектированием, причем определение часто проводят после предварительной пробоподготов-ки, для осуществления которой в основном используют метод твердофазной экстракции (ТФЭ). Сложная проблема, с которой часто сталкиваются при пробоподготовке объектов, содержащих метилксантины, связана с высокой гидро-фильностью этих соединений (]gP = —1.1—0.3), вследствие чего эффективность концентрирования оказывается невысокой.
Как показали исследования последних лет, весьма перспективными сорбентами для ТФЭ полярных органических соединений оказались сверхсшитые полистиролы. Эти сорбенты отличаются высокоразвитой удельной поверхностью, относительно малыми порами и выраженным сродством к различным органическим соединениям. С применением сверхсшитых полистиролов разработаны методики сорбционного выделения и концентрирования фенолов [18], первичных алифатических аминов [19], фенолкарбоновых кислот [20], сульфаниламидов [21], кофеина и теофиллина [22].
Цель настоящей работы — изучение возможности сочетания ТФЭ метилксантинов (кофеина, теофиллина, теобромина, дипрофиллина и пен-токсифиллина) на микроколонке, заполненной сверхсшитым полистиролом (ССПС), с последующим определением этих соединений в элюате методом ВЭЖХ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектами исследования сорбции служили кофеин (Roth, 99.0%), теофиллин (Acros organics, 99.0%), теобромин (Sigma-Aldrich, 99.0%), дипро-филлин (Fluka analytical, 97.0%) и пентоксифил-лин (Sigma-Aldrich). Структурные формулы изученных веществ приведены на рис. 1. Исходные (0.001—0.005 М) растворы метилксантинов готовили растворением их точных навесок в воде. Рабочие растворы соединений готовили разбавлением исходных непосредственно перед использованием.
В качестве сорбента использовали сверхсши-тый полистирол, используемый в патронах Диа-пак П-3 (ЗАО БиоХимМак, Россия) (удельная поверхность 1020 м2/г, степень сшивки 100%, размер частиц 50—100 мкм, диаметр пор 1—100 нм).
Спектры поглощения и оптические плотности растворов регистрировали на спектрофотометре СФ-103 ("Аквилон", Россия), pH контролировали на иономере "Эксперт 001" (Россия). Использовали перистальтический насос ЛАБ-НП-1-20М (Россия).
Хроматографическую часть работы выполняли на жидкостном хроматографе "Цвет-Яуза-04" со спектрофотометрическим детектором (280 нм). Разделение проводили в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. Использовали хроматографическую
I
R2
Теофиллин, 1,3-диметилксантин
(R1=CH3, R2=CH3, R3=H) Теобромин, 3,7-диметилксантин
(RX=H, R2=CH3, R3=CH3) Кофеин, 1,3,7-триметилксантин (Rj=CH3, R2=CH3, R3=CH3) Дипрофиллин, 7-(2,3-диоксипропил)теофиллин (Rj=CH3, R2=CH3, R3=CH2CH(OH)CH2CH) Пентоксифиллин, 1-(5-оксогексил)теобромин (Ri=(CH2)4C(O)CH3, R2=CH3, R3=CH3)
Рис. 1. Структурные формулы изученных метилксантинов.
колонку Luna 5u C18(2) (150 х 3.0 мм, 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовали водно-ацето-нитрильные смеси с добавлением фосфорной кислоты. Пробу объемом 20 мкл вводили с помощью петли дозатора. Скорость потока составляла 0.5 мл/мин. Дистиллированную воду для приготовления элюента дополнительно очищали с помощью системы очистки воды Millipore. Элюент дегазировали в ультразвуковой ванне Bransonic 1510R-DTH (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сорбционное концентрирование метилксантинов на ССПС. Для разработки методики группового динамического сорбционного концентрирования МК использовали микроколонку (25 х 2.7 мм), заполненную 0.055 г ССПС. Размеры колонки подбирали таким образом, чтобы, с одной стороны, обеспечить количественное извлечение МК, а с другой — десор-бировать их минимальным объемом элюента. Сорбцию проводили из 25 мл 0.01 мМ водных растворов кофеина, теофиллина, теобромина, дипро-филлина и пентоксифиллина (pH ~ 6) с использованием перистальтического насоса. Скорость пропускания раствора через колонку составила 0.7 мл/мин. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, метилксантины сорбируются в этих условиях на 97—100%. На примере кофеина показано, что степень извлечения изменяется незначительно при увеличении объема анализируемой пробы до 100 мл и составляет 95 ± 4%. При осуществлении десорбции в противотоке МК количественно элюируются с микроколонки 0.5—1 мл метанола (табл. 1).
Таблица 1. Степени извлечения (^сорб, %) метилксантинов из 25 мл раствора (рН ~ 6) на микроколонке, заполненной 0.055 г ССПС, и степени их десорбции 0.5 и 1 мл метанола (сМК = 1 х 10-5 М, п = 3, Р = 0.95)
Соединение Rсорб, % ^десорб (0.5 мл), % ^десорб (1-0 мл), %
Пентоксифиллин 100 ± 3 82 ± 5 91 ± 3
Кофеин 98 ± 2 89 ± 5 95 ± 5
Теофиллин 97 ± 2 99 ± 3 100 ± 2
Теобромин 97 ± 3 75 ± 6 90 ± 6
Дипрофиллин 97 ± 3 86 ± 6 94 ± 5
Таблица 2. Выбор подвижной фазы для разделения смесей метилксантинов
Смесь метилксантинов Элюент Время анализа, мин
Теобромин, теофиллин, кофеин Ацетонитрил — 0.1%-ный водный 10
раствор Н3Р04 (10 : 90, рН 3.5)
Теобромин,дипрофиллин,кофеин Тот же 10
Теобромин, теофиллин, кофеин, пентоксифиллин » 55
Теобромин, теофиллин, дипрофиллин, кофеин Ацетонитрил — 0.1%-ный водный 25
раствор Н3Р04 (5 : 95, рН 3.5)
Пентоксифиллин Ацетонитрил — 0.1%-ный водный 5
раствор Н3Р04 (30 : 70, рН 3.5)
Выбор условий хроматографического разделения и определения метилксантинов. Разделение модельной смеси метилксантинов проводили на колонке Luna 5u C18. Для выбора оптимальных условий разделения варьировали содержание ацетонитрила, воды и H3PO4 в подвижной фазе (табл. 2). В качестве примера на рис. 2 приведена хроматограмма разделения четырехкомпонент-ной модельной смеси метилксантинов при использовании в качестве подвижной фазы смеси
mAU
150
100
50
_|_1_
_i_L_
_|_1_
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
t, мин
Рис. 2. Хроматограмма разделения теобромина (1), теофиллина (2), дипрофиллина (3) и кофеина (4) на колонке Luna 5u C18. Элюент: ацетонитрил — 0.1%-ный водный раствор H3PO4 (5 : 95; pH 3.5).
(5 : 95; pH 3.5) ацетонитрил — 0.1%-ный водный раствор H3PO4.
На основании анализа данных, приведенных в табл. 2, видно, что за приемлемое время анализа (менее 10 мин) на колонке Luna 5u C18 возможно разделение теобромина, теофиллина и кофеина, либо теобромина, ди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.