ш
УДК 577.(152.34+112.7)
КОНЪЮГАТЫ СТРЕПТОКИНАЗА-ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ И СНИЖЕННЫМИ ПОБОЧНЫМИ ЭФФЕКТАМИ
© 2014 г. Р. Б. Айсина*, #, Л. И. Мухаметова*, Д. В. Тюпа*, К. Б. Гершкович**,
Д. А. Гулин**, С. Д. Варфоломеев*
*ГУНУХимический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119992, Москва, Ленинские горы **ФГБУНИнститут биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 03.10.2013 г. Принята к печати 14.04.2014 г.
Ковалентные конъюгаты СК-ПЭГ2 и СК-ПЭГ5 с различными степенями модификации аминогрупп белка получены вариацией времени инкубации стрептокиназы (СК) с активированным по-лиэтиленгликолем (M 2 и 5 кДа, ПЭГ2 и ПЭГ5); изучены их свойства в сравнении со свойствами свободной СК in vitro. Показано, что максимально стабильные в плазме и сохраняющие 80% исходной фибринолитической активности конъюгаты СК-ПЭГ2 и СК-ПЭГ5 образуются при степенях модификации аминогрупп белка 54 и 52% соответственно. При взаимодействии данных конъ-югатов с плазминогеном в эквимолярных концентрациях образуются активаторные комплексы плазмина (Пл) ПлСК-ПЭГ2 и ПлСК-ПЭГ5, максимальная амидазная активность которых равна активности комплекса Пл с нативной СК. Найдено, что каталитическая эффективность активации плазминогена (кПг/КПг) комплексом ПлСК-ПЭГ2 немного выше (2.84 мин-1 мкМ-1), а комплексом ПлСК-ПЭГ5 ниже (1.17 мин-1 мкМ-1), чем немодифицированным комплексом ПлСК (2.1 мин-1 мкМ-1). Исследование кинетики лизиса сгустков из плазмы крови человека и истощение уровней плазминогена и фибриногена в плазме под действием равных доз свободной СК и указанных конъюгированных образцов СК показало, что конъюгаты СК-ПЭГ2 и СК-ПЭГ5 обладают высокой тромболитической активностью (89 и 72% от активности свободной СК соответственно) и вызывают в 3.5-4 раза меньшие побочные эффекты, чем свободная СК. Полученные нами конъюгаты СК-ПЭГ2 и СК-ПЭГ5 с повышенной стабильностью в плазме и низким уровнем побочных эффектов могут быть использованы в терапии тромботических заболеваний.
Ключевые слова: стрептокиназа, плазминоген, конъюгаты с полиэтиленгликолем, активность, стабильность, полиэтиленгликоль, фибриноген.
Б01: 10.7868/80132342314050029
ВВЕДЕНИЕ
Особое место среди белковых лекарственных препаратов, вводимых в кровоток, занимают активаторы плазминогена (АП), которые используются в терапии тромбоэмболических заболеваний. АП различаются по механизму действия, каталитической эффективности и фибринспецифичности действия (т.е. способности активировать плазми-ноген непосредственно на фибриновом сгустке), но все они быстро выводятся из кровотока (тй =
Сокращения: рКА — п-нитроанилид; ТЫВ8 — тринитро-бензолсульфокислота; АП — активаторы плазминогена; Пг — плазминоген; Пл — плазмин; ПЭГ — полиэтиленгликоль; СК — стрептокиназа; СК-ПЭГ — ковалентный конъ-югат стрептокиназа-полиэтиленгликоль, Фг — фибриноген.
# Автор для связи (факс: (495) 939-54-17; эл. почта: aisina2004@mail.ru).
= 3—18 мин) [1]. Поэтому в терапии тромбозов используют высокие дозы АП, которые вводят длительной инфузией, а это вызывает превращение не только фибринсвязанного, но и циркулирующего плазминогена (Пг) в активную фибринолитиче-скую форму — плазмин (КФ 3.4.21.7) [1—3]. Плаз-мин, связанный с фибрином, растворяет его, а плазмин, образовавшийся из свободного плазминогена, разрушает фибриноген, факторы V, VII и протромбин в плазме, что вызывает серьезный дефект коагуляции, являющийся причиной геморрагических осложнений [1]. Единого решения для устранения недостатков всех АП нет. С целью снижения побочных воздействий на важные белки плазмы и повышения длительности циркуляции в кровотоке АП включают в микро/наноча-
стицы, липосомы и гидрогели, проводят мутацию и химическую модификации их молекул.
В последнее время заметно вырос интерес ученых к стрептокиназе (СК) — бактериальному активатору плазминогена. Ее преимуществами по сравнению с другими АП, являются высокая каталитическая эффективность (кПг/КПг) в реакции активации плазминогена, низкая стоимость и широкий клинический опыт применения. К недостаткам СК относятся ее нестабильность, им-муногенность и быстрое выведение из кровотока. СК — одноцепочечный белок (47 кДа), не обладающий собственной ферментативной активностью. СК — не прямой активатор плазминогена, она образует эквимолярный комплекс с плазминогеном (ПгСК) [4, 5], который быстро (к1 = 0.24 мин-1) превращается в комплекс плазмин-стрептокиназа (ПлСК) [6]. Комплексы ПгСК и ПлСК активируют избыток плазминогена, однако комплекс ПлСК не стабилен и теряет активаторную активность из-за деградации его СК-части [7, 8].
С целью улучшения свойств СК предпринимались попытки ее модификации различными способами. Получены обратимо ацилированные по активному центру производные комплекса ПгСК пролонгированного действия [9, 10]. Получены рекомбинантные варианты СК с повышенной сопротивляемостью к деградации плазмином [11, 12]. Разработан конъюгат СК с декстраном (М 35-50 кДа), сохранивший лишь 50% исходной активности, но циркулирующий в кровотоке до 3 дней [13, 14]. Недостатками СК, включенной в липосомы, являлись нестабильность липосом, низкая эффективность включения и большая потеря активности агента [15, 16]. Предложена СК, микрокапсулированная в оболочку из полиэти-ленгликоля (ПЭГ), защищающую агент от контакта с белками крови до его высвобождения (от 30 до 90 мин) [17, 18].
Ковалентное присоединение ПЭГ (или ПЭГили-рование) все чаще используется при создании белковых медицинских препаратов для повышения времени их циркуляции в крови, сохранения биоактивности и снижения антигенности белков [19, 20]. ПЭГилированию СК посвящено небольшое число работ. Коиде с соавторами получили конъюгат СК с ПЭГ (М 5 кДа) с потерей 67% активности агента [21]. Эти конъюгаты не реагировали с анти-стрептокиназной сывороткой. Позднее с использованием нового метода активации ПЭГ получены конъюгаты СК с ПЭГ (М 2, 4 и 5 кДа) с минимальной потерей ее активности [22, 23].
Описанные конъюгаты СК-ПЭГ имели очень низкую реактивность к стрептокиназным антителам и значительно медленнее выводились из кровотока, чем свободная СК. Однако каталитическая эффективность активации плазминогена конъюгатами СК-ПЭГ была в 4-10 раз ниже, чем
свободной СК [22]. Это может быть связано с высокой степенью ПЭГ-модификации молекулы СК, использованием ПЭГ со свободными концевыми ОН-группами, а также со стерическими затруднениями, создаваемыми ПЭГ различной молекулярной массы. Конъюгация СК с биосовместимым и не токсичным ПЭГ весьма перспективна для снижения побочных эффектов применения свободной СК и повышения ее стабильности в кровотоке при терапии. Однако исследований по ПЭГ-модификации СК крайне мало, и только одно из них посвящено изучению кинетических свойств СК-ПЭГ-конъюгатов [21].
Для ПЭГилирования СК мы использовали мо-нометокси-ПЭГ молекулярной массы 2 и 5 кДа (ПЭГ2 и ПЭГ5). С целью оптимизации метода получения ковал ентных СК-ПЭГ-конъюгатов исследовано влияние степени ПЭГилирования молекулы СК на стабильность в плазме, тромбо-литические и побочные эффекты полученных конъюгатов in vitro, а также на кинетику образования активаторных комплексов ПлСК-ПЭГ и кинетические параметры активации плазминогена этими комплексами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Стрептокиназа является наиболее доступным, эффективным и хорошо изученным в клинической практике тромболитическим агентом, но ее введение в терапевтических дозах сопровождается истощением уровней фибриногена и плазмино-гена в плазме крови, а также образованием антител к ней. Кроме того, СК теряет тромболитическую активность в плазме, содержащей высокие концентрации плазминогена, из-за ее протеолитиче-ской деградации в составе образующегося комплекса Пл.СК. Литературные данные указывают на то, что из современных методов модификации белков наиболее подходящими для стабилизации СК к протеолитической деградации являются те, в которых полимер, или носитель, ковалентно связывается с остатками аргинина или лизина молекулы СК. Так происходит потому, что пептидные связи, образованные СООН-группами именно этих аминокислот, расщепляются плаз-мином и другими протеазами, а появление высокомолекулярного заместителя по боковой цепи создает стерические затруднения для протеолиза. ПЭГилирование является одним из перспективных методов для улучшения фармакокинетиче-ских и терапевтических свойств СК, так как активированный ПЭГ связывается с s-аминогруппа-ми остатков лизина в молекуле СК.
ПЭГ — один из хорошо изученных полимеров для модификации белков — одобрен FDA (Food and Drug Administration, USA) для использования в качестве носителя, или основы, в косметике и
фармацевтике, включая инъецируемые, перо-ральные, ректальные или назальные формы [24]. ПЭГ не иммуногенен, мало токсичен и выводится из организма через почки (для ПЭГ < 30 кДа) в интактном виде [25].
При модификации СК был использован ПЭГ с молекулярными массами 2 и 5 кДа (ПЭГ2 и ПЭГ5), в которых один конец защищен метокси-группой для исключения возможности связывания двух молекул СК с молекулой ПЭГ. При оп-
тимизации метода ПЭГилирования СК особое внимание уделено максимальному сохранению активаторной и тромболитической активности агента.
Получение конъюгатов СК с ПЭГ. Активацию монометокси-ПЭГ 1,1'-карбонилдиимидазолом проводили по методике, описанной в работе [26]. К раствору СК, предварительно очищенной на колонке с плазминоген-сефарозой 4В, добавляли раствор активированного ПЭГ (схема).
1. Активация монометокси-ПЭГ 1,1'-карбонилдиимидазолом:
О
А
НО'
СН3 V Ч/ N^7
О
СН3
ПЭГ 1,1'-Карбонилдиимидазол Активированный ПЭГ
+
О
СК-МН
СК^Н
;
■2
■«СН3
Конъюгат СК-ПЭГ
Схема. Схема получения конъюгатов СК-ПЭГ.
В ходе реакции модификации для оценки активности ПЭГилированной СК измеряли остаточную фибринолитическую активность разбавленных проб СК по методу Кристенсена, как описано в работе [27]. Как видно из рис. 1, активность СК падает с увеличением времени ее инкубации с ПЭГ. Для максимального сохранения ак-
я
с,
а X
к О
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.