ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 3, с. 341-344
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.115.3:612.115.064
КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИЙ ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ И ИНСУЛЯРНОЙ СИСТЕМ ОРГАНИЗМА РЕГУЛЯТОРНЫМ ПЕПТИДОМ
LEU—PRO—GLY—PRO
© 2013 г. Н. Ф. Мясоедов*, Л. А. Андреева*, Л. А. Ляпина**, Т. А. Шубина**,
М. Е. Григорьева**, Т. Ю. Оберган**
*Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, 2 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, каф. физиологии человека и животных, 119992 Москва, Ленинские горы, 1, корп. 12 E-mail: lyapinal@mail.ru Поступила в редакцию 26.06.2012 г.
Установлено, что пептид Leu—Pro—Gly—Pro обладает гипогликемическим и антитромботическим действием. Отмечено, что 5-кратное интраназальное его введение крысам в дозе 1 мг/кг массы тела на фоне развития стойкой гипергликемии нормализует нарушенные функции противосвертываю-щей и инсулярной систем организма. У подопытных животных происходит снижение уровня сахара крови, агрегации тромбоцитов и повышение антикоагулянтной и всех видов фибринолитической (суммарной, неферментативной, ферментативной, Хагеман-зависимой) активности в плазме крови.
DOI: 10.7868/S0002332913030077
Выявлена зависимость между повышением уровня сахара крови и дисфункцией противо-свертывающей системы (ПСС) (Кудряшов, 1993). Сохранение нормальной функции инсулярной и противосвертывающей систем крови на фоне развития аллоксанового диабета у крыс обеспечивают регуляторные пептиды глипролинового ряда Pro—Gly— Pro, Pro—Gly, Pro—Gly—Pro—Arg (Ашмарин и др., 2008; Ляпина и др., 2010), которые образуются в организме при протеолизе коллагена и других родственных ему белков (Molinero etal., 2008). При этом в плазме крови повышаются антикоагулянтно-фибринолитическая (Ашмарин и др., 2002; Ляпина и др., 2006) и антитромбоцитар-ная (Пасторова и др., 2003) активности. Известно, что аминокислота лейцин играет важную роль в процессах предупреждения развития диабета (Балаболкин и др., 2008), стимулируя выработку инсулина поджелудочной железой (Duttaroy et al., 2005). Показано, что глипролины, в том числе Pro—Gly—Pro—Leu, используемые в условиях развития экспериментального сахарного диабета, обладают как профилактическим, так и терапети-ческим гипогликемическим эффектом (Ляпина идр., 2010; Григорьева и др., 2011; Мясоедов и др., 2011).
Традиционная гипогликемическая терапия, применяемая при заболевании диабетом 2-го типа, может вызывать побочные эффекты, напри-
мер, потерю веса, тошноту, желудочно-кишечные нарушения (Meade, 2009).
Цель работы — изучение противосвертываю-щей и гипогликемической активности одного из пептидов глипролинового ряда с включенным лейцином с N-конца молекулы, а именно Leu— Pro—Gly—Pro (LPGP), при развитии стойкой гипергликемии, подобной возникающей при сахарном диабете 2-го типа у человека, и снижению функции ПСС.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пептид LPGP был синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН. Эксперименты проводились на 65 беспородных белых крысах-самцах в возрасте 5-6 мес. с массой тела 200—220 г., содержащихся на естественном лабораторном рационе.
Стойкую гипергликемию у животных вызывали ежесуточным (1 раз в сутки) внутрижелудоч-ным введением 40%-ного раствора глюкозы в дозе 0.5 мл на 200 г массы тела в течение 25 сут и дополнительным внутримышечным введением с 13-х по 15-е сут (1 раз в сутки) 10%-ного раствора протаминсульфата (для усиления гипергликемии) в дозе 2 мг/0.2 мл/200 г массы тела крыс. С 16-х сут эксперимента животные были разбиты на две группы — опытную и контрольную. Опытной группе крыс вводили 5-кратно интраназально
Таблица 1. Уровень сахара крови и показатели гемостаза после пятикратного интраназального введения крысам пептида ЬРОР на фоне сахарной нагрузки (М ± т)
Показатель крови Норма Контроль (0.85%-ный NaCl) Опыт (пептид LPGP)
Уровень сахара, ммол/л 4.3 ± 0.4 4.7 ± 0.5 4.6 ± 0.3
АЧТВ, с 27.4 ± 2.77 26.9 ± 1.4 31.4 ± 0.85 **
СФА, мм2 36.5 ± 0.5 26.2 ± 1.1## 32.9 ± 1.1 **
НФ, мм2 25.6 ± 0.4 20.3 ± 0.7## 24.0 ± 0.9 **
Агрегация тромбоцитов, индекс 8.9 ± 0.4 8.15 ± 0.55 6.81 ± 0.5*
ОФА, мм2 39.0 ± 3.4 30.3 ± 1.5## 74.8 ± 4.3 **
ААП, мм2 16.5 ± 0.6 6.5 ± 0.7## 24.8 ± 4.1**
ХЗФ, мин 4.0 ± 0.3 8.7 ± 0.9## 3.9 ± 0.4**
Примечание. АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время, СФА — суммарная фибринолитическая, НФ — неферментативная фибринолитическая, ОФА — общая фибринолитическая активности, ХЗФ — Хагеманзависимый фибри-нолиз, ААП — активность тканевого активатора плазминогена.
Статистические показатели рассчитаны: относительно соответствующих проб нормы (#р < 0.05, ## р < 0.01) или контроля (*р < 0.05, **р < 0.01). Для табл. 1, 2.
раствор пептида LPGP (по 0.02 мл/200 мкг на 200 г массы тела, 2 раза в сутки через каждые 12 ч), а контрольной группе подобным образом вводили 0.85%-ный раствор NaCl. На 18-е сут эксперимента производили первый забор крови через 30 мин после последнего введения пептида. С 19-х сут введение пептида (или NaCl) отменяли, но продолжали вводить глюкозу. Второй забор крови производили спустя 7 сут после отмены применения пептида (или NaCl) при продолжающемся введении глюкозы, т.е. на 25-е сут эксперимента. Брали 2 мл крови брали из v. jugularis с использованием в качестве консерванта 3.8%-но-го раствора лимоннокислого натрия в соотношении кровь : консервант как 9 : 1. В работе дополнительно использовали группу здоровых животных (норма).
Определяли следующие биохимические параметры плазмы крови: суммарную (СФА) и неферментативную (НФ) фибринолитические активности (Kudrjashov, Lyapina, 1986), активность тканевого активатора плазминогена (ААП) (Astrup, Müllertz, 1952), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) (Долгов и др., 2005), Хагеман ^^^зависимый фибринолиз (ХЗФ) с использованием тест-набора НПО "Ренам" (Россия), общую фибринолитическую активность (ОФА) по времени лизиса эуглобулиновой фракции плазмы. В плазме крови, обогащенной тромбоцитами, определяли агрегацию тромбоцитов методом Берковского с соавт. (2003) с использованием 2—5 мкМ раствора аденозин-5 -дифосфа-та (АДФ) в качестве агреганта; определение проводили на агрегометре (МГУ). Концентрацию сахара крови измеряли на анализаторе Accutrend GC (Roche, Франция) с помощью тест-полосок для количественного определения сахара. Образ-
цы крови центрифугировали в разных режимах: для определения агрегации тромбоцитов — при 1000 % в течение 5 мин (получали богатую тромбоцитами плазму), а для коагулологических тестов и определения уровня сахара в крови использовали бедную тромбоцитами плазму, для чего образцы повторно центрифугировали при 3000 % в течение 10—12 мин.
Все данные были обработаны статистически по методу Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что в условиях эксперимента (после первого забора крови) у контрольной группы животных наблюдалось достоверное снижение фибринолитической активности по сравнению с нормой. Так, изменение показателей СФА, НФ, ОФА, ААП и ХЗФ указывало на депрессию фибринолитического звена ПСС (табл. 1). Пептид ЬРОР, введенный крысам на фоне сахарной нагрузки, достоверно повышал антикоагу-лянтную активность крови (по тесту АЧТВ); фибринолиз - активность ААП (по тестам СФА и НФ), которая повысилась в 3.8 раза; ОФА и ХЗФ, которые увеличились в 2.5 и 2.2 раза соответственно, по сравнению с теми же показателями у контрольных животных. В опыте агрегация тромбоцитов имела тенденцию к снижению по сравнению с контролем. Уровень сахара в опытных и контрольных пробах был практически одинаков (табл. 1). Следовательно, пептид в данных условиях нормализовал повышенную свертываемость крови, возникающую на фоне сахарной нагрузки, но не влиял на уровень сахара крови.
Через 7 сут после отмены введения пептида или №С1, но при продолжающемся введении
КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИЙ
343
Таблица 2. Уровень сахара в крови и показатели гемостаза на 25-е сут сахарной нагрузки и через 7 сут после отмены введения крысам пептида ЕРОР (М ± т)
Показатель крови Норма Контроль (0.85%-ный NaCl) Опыт (пептид LPGP)
Уровень сахара, ммол/л 5.3 ± 0.1 5.3 ± 0.6 4.4 ± 0.2
АЧТВ, с 28.2 ± 0.82 25.9 ± 0.5# 31.4 ± 0.85 **
СФА, мм2 34.6 ± 0.9 29.6 ± 1.4## 39.3 ± 1.4 **
НФ, мм2 24.1 ± 0.4 21.3 ± 1.1# 28.0 ± 1.2 **
Агрегация тромбоцитов, индекс 8.8 ± 0.41 11.5 ± 0.68 6.85 ± 0.5 **
ОФА, мм2 53.0 ± 9.2 28.1 ± 3.1# 43.3 ± 7.5 *
ААП, мм2 24.0 ± 7.8 6.6 ± 1.8## 8.5 ± 2.6**
ХЗФ, мин 3.4 ± 0.1 8.9 ± 0.7## 3.5 ± 0.5**
глюкозы (второй забор крови), выявлены более достоверные изменения уровня сахара в крови и агрегации тромбоцитов в опытных пробах по сравнению с контролем. Уровень глюкозы уменьшился в опыте на 1.2 мМ/л по сравнению с контролем, а агрегация тромбоцитов снизилась в 1.7 раза. В опыте антикоагулянтная активность (по АЧТВ) и все виды фибринолитической активности (СФА, НФ, ААП, ОФА и ХЗФ) сохранялись на достоверно повышенном по сравнению с контролем уровне (табл. 2).
Следовательно, пептид Leu—Pro—Gly—Pro даже при 5-кратном применении на фоне сахарной нагрузки оказывал гипогликемическое, антит-ромбоцитарное, антикоагулянтное, а также как ферментативное, так и неферментативное фиб-ринолитическое действие. Сравнивая гипоглике-мическое и противосвертывающее действие этого пептида (лейцин расположен с N-конца молекулы) — Leu—Pro—Gly—Pro с действием глипроли-на, содержащим лейцин с С-конца — Pro—Gly— Pro—Leu (Оберган и др., 2013), следует отметить, что используемый в настоящем исследовании Leu—Pro—Gly—Pro оказывал гипогликемическое действие в меньшей степени, и оно проявлялось в более отдаленные сроки в отличие от действия пептида Pro—Gly—Pro—Leu, применяемого в тех же условиях на фоне сахарной нагрузки. Кроме того, у Leu—Pro—Gly—Pro был выявлен антитром-боцитарный эффект, в то время как Pro—Gly— Pro—Leu практически не влиял на агрегацию тромбоцитов.
Таким образом, пептид Leu—Pro—Gly—Pro может быть рекомендован как препарат направленного гипогликемического и тромболитического действия в организме, сочетающего антикоагу-лянтную, фибринолитическую и антитромбо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.