МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 480-490
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 578.088
КОРРЕЛЯЦИЯ МЕЖДУ МАКРО- И МИКРОСТАБИЛЬНОСТЬЮ СН2-ДОМЕНОВ IgG2 ЧЕЛОВЕКА И ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ. I. АНАЛИЗ КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ И ОПТИЧЕСКИХ КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ © 2014 г. В. М. Тищенко*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, Пущино, Московская область, 142290 Поступила в редакцию 17.10.2013 г. Принята к печати 25.11.2013 г.
Миеломные иммуноглобулины человека второго подкласса LOM и SIN, а также их Fc- и впервые полученные hFc-фрагменты, у которых присутствует не только "нижний" участок шарнирной области, но и его "сердцевина" (Cys-Cys-Vl-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys), изучены с помощью ряда физических методов (сканирующая калориметрия, флуоресцентная спектроскопия, аналитическое центрифугирование). Совместный анализ калориметрических и оптических кривых плавления позволил установить, что единственный низкотемпературный пик теплопоглощения на всех кривых плавления соответствует плавлению двух Сн2 доменов. Показано, что в составе интактного IgG2 по сравнению с hFc- и Fc-фраг-ментами Сн2-домены дестабилизированы.
Ключевые слова: иммуноглобулин IgG2, Fc и hFc-фрагменты, Сн2-домены, термостабильность.
CORRELATION BETWEEN MACRO- AND MICRO-STABILITY CH2 DOMAINS OF HUMAN IgG2 AND THEIR BIOLOGICAL ACTIVITY. 1. ANSALYSIS THE CALORIMETRIC AND OPTICAL MELTING CURVES, by V. М. Tischenko (Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Science, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia; *e-mail: tischen@vega.protres.ru). Human myeloma immunoglobulin second subclass LOM and SIN, their Fc fragment and firstly obtained hFc fragment in which there is not only low portion of the hinge region, but also its core portion (Cys-Cys-Vl-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys), have been studied by number of physical methods (scanning calorimetry, fluorescence spectroscopy, analytical centrifugation). Joint analysis of calorimetric and optical melting curves revealed that only first (low-temperature) heat absorption peak at all the melting curves corresponds to the melting of the two CH2 domains. It was shown that CH2 domains of intact IgG2 are destabilized relative to those domains in hFc and Fc fragments.
Keywords: immunoglobulin IgG2, Fc and hFc fragments, С^ domain, stability. DOI: 10.7868/S0026898414030203
Молекулы иммуноглобулинов класса О (1§О) состоят из двух идентичных тяжелых и двух идентичных легких цепей (Н2Ц) [1]. Две БаЬ-субъеди-ницы образованы М—концевыми половинами Н-цепей и Ь-цепями, а С-концевые половины Н-це-пей формируют одну Бе-субъединицу [2, 3]. Последняя отвечает за эффекторные функции: взаи-
модействие с фактором системы комплемента C1q и многочисленными клеточными рецепторами [3]. Fab и Fc соединены так называемым "шарнирным" участком, включающим жесткую "сердцевину" (core hinge), образованную двойной поли-Ь-пролиновой спиралью, перешитой дисульфидными связями, более гибкого верхне-
Принятые сокращения: IgG — иммуноглобулины класса G; H (Ь)-цепи — тяжелые (легкие) цепи, VH — вариабельные домены тяжелой цепи; VL — вариабельные домены легкой цепи; Ch2(3) — константные домены, образующие Fc-субъединицу (фрагмент); Fv-субфрагмент — структура, образованная парой вариабельных доменов Vl—Vh h — шарнирный участок, соединяющий в IgG две Fab- и одну Fc-субъединицу; DSS — дисукцинимидный эфир пробковой кислоты, гомобифункцио-нальный реагент; SPDP — К-сукцининилимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат; FITC — флуоресцеинизотиоцианат, флуоресцентная метка; Тпл, ДНпл, Д5пл, ДОст — температура, энтальпия, энтропия плавления и свободная энергия стабилизации Сн2-домена.
* Эл. почта: tischen@vega.protres.ru
го (upper hinge) и нижнего (low hinge) сегментов, обеспечивающих подвижность субъединиц в молекуле [4—7]. Fc-фрагмент, который может быть получен в ходе ограниченного протеолиза с помощью ряда ферментов, включает Сн2- и два Сн3-домена, а также, как правило, "сердцевину" шарнирного участка (либо ее часть в случае hFc IgG3 человека) с межцепочечными дисульфидными связями.
Методом рентгеноструктурного анализа изучены Ig человека только первого подкласса [4, 8, 9], однако вполне логично предположить, что структура молекул всех подклассов очень схожа. В частности, для большинства доменов всех IgG характерны тесные контакты между доменами, принадлежащими соседним цепям (VH-VL, CH1-CL, Сн3-Сн3) [10, 11]. Исключением являются Сн2-домены, взаимодействия между которыми сводятся, по существу, лишь к нескольким контактам их углеводных компонент. Эти компоненты локализованы в гликозилирован-ных консервативных Asn297 [12—14]. Наблюдаемый набор взаимодействующих пар находится в полном согласии с полученными нами термодинамическими данными. Взаимодействующие пары доменов образуют кооперативные блоки [15—17], а Сн2-до-мены сами по себе кооперативны таковыми [17, 18].
Между тем, именно в Сн2-доменах IgG локализованы участки, которые вовлечены в реализацию многих эффекторных функций, в частности в активацию системы комплемента по классическому пути [19]. Ключевую роль в этом процессе играет связывание фактора dq, за взаимодействие с которым ответственна группа заряженных аминокислотных остатков [20]. Известно, что подклассы IgG человека очень сильно различаются по своей способности активировать данный процесс. Так, IgG2 очень сильно уступает по своей активности IgG1 и IgG3, хотя его Сн2-домены содержат последовательность, соответствующую активному центру IgG1 и IgG3 [3, 19, 21]. И причины этого пока неясны.
Ранее нами показано, что температуры максимума первого пика теплопоглощения у целого ряда IgG различных животных сильно различаются, в том числе и у IgG человека. В ряде случаев есть веские основания полагать, что первый пик связан с плавлением Сн2-доменов [15, 17, 22—25]. Симптоматично, что наименее стабильными, по-видимому, являются Сн2-домены у IgG, обладающих низкой способностью к активации системы комплемента (IgG2) либо вовсе не обладающие таковой (IgG4). Если предположение о различиях в стабильности этих доменов окажется верным, то, возможно, зафиксированные нами различия в термостабильности определенным образом могут быть связаны со способностями IgG разных подклассов активировать систему комплемента.
Чтобы ответить на поставленный вопрос, надо более тщательно его изучить и попытаться свя-
зать отличия в функциональной активности белков с более фундаментальными термодинамическими характеристиками их Сн2-доменов, чем термостабильность.
С этой целью необходимо использовать методы, которые будут чувствительны к состояниям именно Сн2-доменов. Задача нетривиальна, поскольку все домены в молекулах иммуноглобулинов имеют высокую гомологию первичных структур и очень схожие третичные структуры. Вместе с тем пара Сн2-доменов составляет менее 1/6 от общей массы белка. При таких условиях интегральные методы исследования не сулят больших перспектив. Поэтому мы использовали новые подходы, позволяющие фиксировать те изменения конформации, которые происходят только в исследуемых доменах.
Особый интерес представляло изучение IgG2 человека сразу по нескольким веским причинам. Во-первых, его структура (как и структура других подклассов) изучена не столь подробно, как структура IgG1. Во-вторых, у этого белка до недавнего времени не могли получить стандартный Fc-фраг-мент, содержащий ядро шарнирного участка (core hinge). В третьих, именно белки-антитела данного подкласса в настоящий момент рассматривают как наиболее приемлемые кандидаты для терапевтических целей [26].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТТЬ
Выделение, типирование миеломных IgG2 LOM и SIN, получение Fc-фрагментов, CH2- и C^-доме-нов этих белков. IgG2 LOM и SIN выделены из сыворотки крови больных множественной миело-мой по стандартной методике [23], все процедуры проводили в максимально сжатые сроки при температуре 4°С. В дальнейшем в работе использовали лишь белки, срок хранения которых в растворе при 0°С не превышал 2 сут. Принадлежность IgG к определенному подклассу подтверждена при помощи моноспецифических антисывороток в тесте двойной иммунодиффузии в геле [28]. Fc-фрагмен-ты из IgG2 LOM и SIN получены с использованием двух подходов: либо с помощью стандартных процедур путем ограниченного протеолиза папаином [23, 29] или трипсином [30], либо с применением разработанной нами оригинальной модификации подхода на основе трипсинолиза [31]. Этот подход искусственно повышает лабильность желаемого сайта гидролиза (области на границе верхнего сегмента шарнирного участка и его "сердцевины") и одновременно увеличивает стабильность наиболее лабильных и подверженных атаке протеолитическими ферментами участков (в данном случае, Сн2-доменов).
Конкретнее, в последнем случае протеолиз проводили в течение 2 ч в присутствии двукратного из-
бытка Fv-субфрагментов, полученных из антител кролика против Сн2-доменов IgG2 (см. ниже). Реакцию осуществляли в 1 мМ фосфатном буфере, рН 6.0, содержащем 2 мМ цистеина, при соотношении фермент : субстрат 1 : 20 при 35°С. Образовавшиеся в результате Fc- и Fab-фрагменты LOM и SIN отделяли от Fv-субфрагментов и оставшихся интактных IgG гель-фильтрацией при рН 4.0 (10мМ глициновый буфер). Затем Fc- и Fab-фрагменты разделяли с помощью ионообменной хроматографии. Все хроматографические процедуры выполнены по стандартным методикам [23, 29]. Идентификацию Fc- и Fab-фрагментов осуществляли методом иммуноэлектрофореза, используя антисыворотки к легким и тяжелым цепям IgG, а также ко всем белкам сыворотки крови [32]. Анализ с использованием стандартной дансил-хлоридной методики [33] Fc-фрагмента, полученного с помощью нового метода, показал, что на N-конце у него находится Cys, Lys присутствует в минорном количестве. Эти данные указывают, что при описанном выше подходе ограниченный протеолиз происходит в районе верхнего сегмента шарнирного участка, а не в районе нижнего сегмента, как происходит при стандартном подходе [34].
Важно подчеркнуть, что в результате применения нового метода трипсинолиза впервые получен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.