МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 842-849
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫИ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 578.088
КОРРЕЛЯЦИЯ МЕЖДУ МАКРО- И МИКРОСТАБИЛЬНОСТЬЮ СН2-ДОМЕНОВ ЧЕЛОВЕКА И ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ. II. РАСЧЕТ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ СТАБИЛЬНОСТЬ ДОМЕНОВ © 2014 г. В. М. Тищенко*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук,
Пущино, Московская обл., 142290 Поступила в редакцию 11.03.2014 г. Принята к печати 22.04.2014 г.
Термодинамические параметры стабилизации нативной структуры Сн2-доменов миеломных иммуноглобулинов человека второго подкласса LOM и SIN и впервые полученных hFc-фрагментов этих белков определены с использованием метода сканирующей микрокалориметрии. Показано, что уменьшение термостабильности и энергии стабилизации нативной структуры этих доменов в интактных белках в "физиологическом" интервале температур (20—37°С) связано, в основном, с энтропийным фактором.
Ключевые слова: иммуноглобулин ^С2, Ре фрагмент, Сн2-домен, термостабильность, энтальпия и энтропия денатурации, свободная энергия стабилизации нативной структуры.
CORRELATION BETWEEN MACRO- AND MICRO-STABILITY CH2 DOMAINS OF HUMAN IgG2 AND THEIR BIOLOGICAL ACTIVITY. II. CALCULATION OF THERMODYNAMIC FUNCTIONS CHARACTERIZING DOMAINS STABILITY, by V. М. Tischenko* (Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Science, Moscow Region, Pushchino, 142290 Russia; *e-mail: tischen@vega.protres.ru). The thermodynamic parameters of the stabilization of the native structure CH2 domains of human myeloma immunoglobulin LOM and SIN second subclass and their firstly obtained hFc fragments were determined using the methods of scanning microcalorimenry. A decrease in the termal stability and energy stability of the native of these domains in the intact proteins correlated in the "phisiological" range of temperatures (20—37°C), mainly, with entropy factor.
Keywords: immunoglobulin IgG2, Fc fragment, CH2 domain, thermal stability, enthalpy and entropy of dena-turation, free energy of stabilization of the native structure.
DOI: 10.7868/S0026898414050152
Ранее установлено, что термостабильность Сн2-доменов в составе hFc ^е)-фрагментов выше, чем в составе интактного IgG2 (45°С в составе интактных IgG2 LOM и SIN, против 65°С в составе hFc фрагмента [1]). Даже сугубо качественный анализ этих результатов, основанных не на прямых калориметрических, а на эффективных расчетных данных, показывает, что меньшую термостабильность Сн2-доменов в составе интактных белков можно связать с большим вкладом энтро-
пийного фактора [1, 2]. В самом деле, это прямо следует из уравнения
AGCT = АН-TAS, (1)
записанного в форме Td = AHd /A^d при температуре денатурации, когда AGCT = 0.
Однако существует прямая необходимость и возможность для более углубленного и строгого анализа термодинамических данных с помощью сканирующей микрокалориметрии. Во-первых, следует учесть, что данные, полученные с помо-
Принятые сокращения: IgG2 — иммуноглобулины, принадлежащие ко второму подклассу класса G; Сн2 — N-концевые константные домены Fc-субъединицы (фрагмента); h — шарнирный участок, соединяющий в IgG две Fab- и одну Fc-субъ-единицу; Td , AHd , A5d, ДСр, AGCT — температура, энтальпия, энтропия денатурации (плавления), скачок теплоемкости при денатурации и свободная энергия стабилизации Сн2-домена.
* Эл. почта: tischen@vega.protres.ru
щью оптических кривых, не слишком точны. В самом деле, свободную энергию стабилизации нативной структуры домена, фундаментальную термодинамическую функцию А^ст, можно с довольно высокой точностью рассчитать по кривой изменения доли нативного либо денатурированного состояния. Саму кривую перехода определяют на основе интегральных оптических кривых плавления, и расчет ведут, постулируя односта-дийность перехода, по известному выражению
А£ст = -ЯТ1п К, (2)
где К - константа равновесия. Можно рассчитать далее и другие термодинамические параметры. При этом следует учитывать ряд следующих весьма существенных и даже критических моментов. Действительно, из-за более сложной и даже несколько неопределенной процедуры вычленения самого денатурационного перехода из всей интегральной кривой плавления ошибка в определении А^ст будет все-таки заметно выше [1, 2], чем при подобной обработке калориметрической кривой плавления [3, 4], которая является дифференциальной кривой. Ее обработка связана с меньшими экспериментальными ошибками, поскольку для вычленения самого перехода требуется простая линейная экстраполяция до- и постденатурационых изменений парциальной теплоемкости белка [3, 4]. Затем определяют эффективную энтальпию перехода из интегральной кривой по известному выражению
АН = ЯТ2 й1п К/йТ, (3)
с большей погрешностью, чем калориметрическую энтальпию из дифференциальной кривой, поскольку в первом случае процедура основана на дифференцировании исходной интегральной кривой. Соответственно, при таком подходе относительно невелика и точность определению энтропии, которую можно рассчитать по уравнению (1). Во-вторых, следует иметь в виду, что все определенные таким образом термодинамические величины не являются экспериментальными (кроме эффективной константы равновесия К), а расчеты проведены на основе априорного предположения об одностадийности перехода каждого из двух идентичных и слабо взаимодействующих Сн2-доме-нов [1, 2]. При этом калориметрическая энтальпия плавления этих доменов должна вдвое превосходить эффективную. Действительно, мы такую картину неоднократно фиксировали ранее при изучении 1§С и их Бе-фрагментов [5—7], и это полностью соответствует данным рентгенострук-турного анализа [8—14].
Между тем данные работы [1] показывают, что
соотношение АНТ/АН е достоверно больше двух. Это может быть связано с различной термостабильностью доменов, обусловленной наличием консервативного гликозилированного Азп297
[15—19]. Углеводная компонента не является гомогенной. Ранее неоднократно показано, что она влияет на термостабильность Сн2-доменов в составе интактных белков и их Бе-фрагментов [15—24].
Поэтому необходимо вычислить термодинамические функции по данным сканирующей микрокалориметрии, интерпретация которых уже не требует столь явно априорных предположений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выделение миеломных IgG, получение Fc-фраг-ментов, ^2-доменов этих белков. Все миеломные белки, их фрагменты и домены выделены, очищены и охарактеризованы, как это описано в предыдущих работах [1, 2].
Калориметрические измерения и расчет термодинамических данных. Эксперименты проводили на микрокалориметрах ДАСМ-4А и ДАСМ-4 [1, 3, 4]. Кривые обработаны, как это описано в работе Привалова и Потехина [4]. Величину свободной энергии стабилизации нативной структуры отдельных доменов (кооперативных блоков) А^ст вычисляли по известному уравнению, в котором использованы данные, полученные на основании только калориметрических экспериментов [3, 4, 25]:
АСст = АЛЛ(ГЛ - Т)/Тй - АСр(Т - Т) +
+ ТАСр1п То/ Т. ( )
При этом в данной работе на основании полученных экспериментальных данных (см. ниже) считали, что величина скачка теплоемкости АСр не зависит от температуры.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение температуры и энтальпии денатурации Сн2-доменов
Чтобы рассчитать по уравнению (4) свободную энергию стабилизации нативной структуры белка А^ст и соответствующую энтропию по данным сканирующей микрокалориметрии, необходимо знание трех параметров. Определение каждого из этих параметров связано с экспериментальными ошибками, однако величина этих ошибок достаточно сильно разнится для каждого из них. Температуру стабильности белка и энтальпию его денатурации определяют в случае небольших однодомен-ных белков просто и весьма точно непосредственно из самих кривых плавления исследуемых объектов в том случае, когда этот процесс равновесен, а белок постоянно находится в форме мономера [3, 25-27].
В случае многодоменных белков из-за близости температур плавления разных доменов могут возникнуть определенные проблемы, однако как показывает опыт работы с иммуноглобулинами
или их фрагментами [5, 28, 29], погрешность в определении температуры плавления отдельных кооперативных блоков (доменов) не превышает 1.3°С даже при совместном использовании двух качественно различающихся методов: дифференциального (калориметрического) и интегрального (оптического). Учитывая, что при расчетах всех необходимых термодинамических параметров по формуле (4) используют шкалу температур Кельвина, даже максимальная ошибка в определении стабильности домена не будет сколь-нибудь заметно влиять на точность расчетов.
Энтальпию плавления Сн2-домена также определяют достаточно точно, как площадь под первым пиком теплопоглощения на кривых плавления как интактных IgG2, так и их hFc-фрагмен-тов [1, 2]. Это подтверждают данные, представленные в многочисленных работах [1, 5—7, 16—21, 28], из которых видно, что пики плавления Сн2-до-мена не перекрываются с пиками, которые характеризуют плавление прочих кооперативных структур исследуемых белков. Полученные таким образом калориметрические энтальпии сопоставлены с эффективными энтальпиями, которые определили непосредственно из калориметрических кривых (либо по амплитуде пика, либо по его полуширине), или с помощью кривых плавления, отслеживаемых по изменению оптических параметров. Их сравнение показывает, что калориметрическая энтальпия плавления систематически превышает эффективную у всех образцов (отношение 2.3—2.55 вместо 2), как это видно по данным, представленным в таблице (также см. работу [1]).
Более подробно вопрос о причинах этих расхождений, обусловленных термодинамическими свойствами Сн2-доменов в составе интактных IgG2 LOM и SIN, их Fc-фрагментов и изолиро-
ванных Сн2-доменов разбирается в работах [20] и [21], в которых показано, что углеводные компоненты доменов различаются по содержанию сиа-ловой кислоты. Поэтому представляется, что в данной работе целесообразно представить пока лишь результаты разложения первых пиков для кривых плавления интактного 1§С2 и И
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.