МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 511-515
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК582.288.23.022:546.212
КОРРЕЛЯЦИЯ ВЕЛИЧИНЫ ФРАКЦИИ ПОДВИЖНОЙ ВОДЫ И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ
КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ
© 2004 г. А. Н. Шкидченко*, В. А. Никитин**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Институт биофизики клетки РАН, Пущино Поступила в редакцию 09.06.03 г.
Методом спинового эха ЯМР было установлено, что в лиофилизированных клетках дрожжей сохраняется изолированная подвижная вода (ФПВ). В лиофилизированных дрожжах, выращенных в периодическом режиме, величина ФПВ варьирует от 3.8% в клетках лаг-фазы и стационарной фазы до 0.25% в клетках фазы экспоненциального роста. Жизнеспособность лиофилизированных дрожжей изменяется от 20% для клеток фазы экспоненциального роста до 86% клеток начала стационарной фазы. В лиофилизированных клетках, растущих с постоянной удельной скоростью роста в режиме хемостата, величина ФПВ зависела от природы лимитирующего рост фактора и была минимальной при лимитировании источником углерода. Минимальной оказалась и жизнеспособность этих лиофилизированных дрожжей. Установлена корреляция между жизнеспособностью и содержанием ФПВ в лиофилизированных клетках дрожжей.
Ключевые слова: дрожжи, лиофилизация, фракция подвижной воды, жизнеспособность.
В настоящее время для некоторых эукариот-ных микроорганизмов, в частности дрожжей, известны следующие состояния воды в клетке -свободная, связанная и подвижная изолированная вода (в дальнейшем называемая фракцией подвижной воды - ФПВ). В процессе лиофилизации клетки теряют 80-85% воды. Дальнейшая дегидратация приводит к постепенной потере связанной воды, и клетки переходят в состояние анабиоза. Последнее крайне важно для сохранения организма в неблагоприятных и экстремальных условиях существования [1, 2]. В клетках дрожжей, выдерживающих лиофилизацию, остается изолированная ФПВ. Устойчивость этой фракции воды к дальнейшей сушке может быть объяснена ее изоляцией в отдельных клеточных структурах дрожжей [3]. Проведенные криофракто-графические исследования культур дрожжей, рост которых был лимитирован источниками углерода и азота, показали, что при лимитировании роста азотом число глобулярных субчастиц, выявляемых на криосколах вакуолярных мембран, в 5 раз меньше, чем при лимитировании углеродом. В то же время величина ФПВ при лимитировании роста азотом составляет 3.8% от веса биомассы, а в контрольном варианте лишь 1.6% [4]. Согласно существующим представлениям глобулярные субчастицы, обнаруживаемые на сколах биологических мембран, являются полиферментными комплексами, одна из функций которых связана с проницаемостью [5].
Было показано, что содержание ФПВ в лиофилизированных клетках дрожжей изменяется в зависимости от фазы роста культуры. Доля фракции подвижной воды в клетках культуры фазы экспоненциального роста снижается до нескольких десятых долей процента от веса биомассы по сравнению с 2.5-4.0% в клетках стационарной фазы роста, тогда как подвижность изолированной воды практически не изменяется [6]. Уменьшение доли ФПВ в экспоненциально растущих клетках коррелировало со снижением их прочностных свойств при механическом разрушении, что, по-видимому, связано с их повышенной чувствительностью к воздействию физических и химических факторов в этой фазе роста.
При хемостатном культивировании дрожжей Candida utilis и Saccharomyces cerevisiae на средах с этанолом и глюкозой установлено, что показатели устойчивости клеток к механическому разрушению и величина ФПВ зависели от температуры культивирования в диапазоне 20-40°C. Величина ФПВ была минимальной при оптимальной для роста температуре, возрастала с повышением температуры и резко снижалась в зоне супраоптимальных температур [7]. Однако даже при постоянной удельной скорости роста дрожжей в проточной хемостатной культуре, лимитированной источниками углерода, азота и фосфора, величина ФПВ в высушенных выросших клетках зависела от природы лимитировавшего рост дрожжей фактора [8].
Следует отметить, что исследование влияния природы лимитирующих рост дрожжей факторов на состояние лиофилизированных клеток проводилось в связи с определением их выживаемости при последующей регидратации [9]. При этом разными авторами установлено, что минимальной выживаемостью обладают дрожжи, взятые для лиофилизации в фазе экспоненциального роста, а по мере приближения к стационарной фазе степень выживаемости увеличивается [9, 10]. В этих же условиях нами наблюдалось существенное изменение величины ФПВ.
Таким образом, величина ФПВ в клетках дрожжей может рассматриваться как одна из характеристик их физиологического состояния. Целью работы было установить зависимость жизнеспособности лиофилизированных дрожжей от величины ФПВ.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования являлись культуры дрожжей Candida utilis Y-405, Saccharomyces cere-visiae Y-773, S. vini расы Береговская, Пино-14, Алиготе и Бордо, полученные из музея чистых культур.
Дрожжи C. utilis культивировали периодическим и проточным способами в аппаратах АнКУМ-2 на синтетической питательной среде следующего состава (г/л): NH4NO3 - 1.5; KCl - 0.3; NaCl - 0.1; MgSO4 • 7H2O - 0.25; FeCl3 • 5H2O - 0.0025; глюкоза -20; KH2PO4 - 3.54; Na2HPO4 - 6.92.
Скорость протока питательной среды поддерживали на уровне 0.25 ч-1, концентрацию растворенного в среде кислорода на уровне 30% насыщения, pH в зоне 6.7-6.9 автоматической подтитров-кой 0.5 N NaOH, температуру стабилизировали при 30°C. Дрожжи культивировали при состоянии подвижного равновесия в протоке в течение 30 времен генераций при каждом лимитирующем факторе. При лимитировании роста дрожжей источником углерода пороговая концентрация глюкозы составляла 0.05 г/л, при лимитировании фосфатами - 0.0007 г/л (по 32Р), а пороговая концентрация азота - 0.016 г/л, что обуславливало хемостатный принцип культивирования с лимитированием роста данными факторами [11].
Дрожжи S. vini выращивали периодическим способом в колбах Эрленмейера на качалке с 180 об/мин при 24°C в течение 36 ч на среде Риде-ра с 3% глюкозы в качестве источника углерода.
Образцы биомассы дрожжей для исследования методом спинового эха ЯМР отбирали из культур определенных фаз роста либо режимов культивирования, клетки отделяли на холоду от культу-ральной жидкости центрифугированием, осадок ресуспензировали в 10 мл водопроводной воды, замораживали и лиофилизировали на установке
Edwards в течение 10 ч. Лиофилизированную биомассу дрожжей запаивали в ампулы и хранили в течение 6 мес.
Для регистрации методом спинового эха ЯМР использовали образцы высушенной биомассы дрожжей весом от 0.5 до 1 г, результаты измерений приводили к одинаковому значению (1 г). Спад спинового эха протонного резонанса регистрировали по двухимпульсной методике Хана [12] на спектрометре спинового эха с цифровой регистрацией амплитуды сигналов эха и системой накопления. Каждую точку кривой спада для повышения точности измерений снимали по 10-20 раз. Амплитуду сигналов эха контролировали по эталонным образцам с известным содержанием воды и выражали в относительных единицах, где 30 мг Н20 соответствуют 100 относительным единицам. Количество подвижной воды в высушенной биомассе измеряли по начальной амплитуде сигналов эха, полученной при экстраполяции прямолинейного спада медленной компоненты эха в полулогарифмическом масштабе (логарифм амплитуды сигнала относительно времени спада) к нулевому значению времени. При этом учитывалось, что содержание липидов в дрожжах низкое, и подвижные группы липидов практически не дают вклада в медленную компоненту спада эха.
Жизнеспособность лиофилизированных дрожжей определяли по численности колониеобразу-ющих единиц (КОЕ) высевом на агаризованную питательную среду до лиофилизации, после лио-филизации и после хранения в запаянных ампулах в течение 6 мес.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Регистрация ФПВ в высушенной биомассе дрожжей основана на возможности разделения сигналов спинового эха для протонов (ядер водорода) от молекул или молекулярных групп с различной степенью подвижности. ФПВ в высушенных дрожжах характеризуется медленной компонентой спада спинового эха с временем релаксации Т2 лишь на порядок меньшим, чем Т2 для воды в биологических объектах с нормальной оводненнос-тью, и на три порядка большим, чем Т2 от неподвижных или малоподвижных молекул [1].
На рис. 1 приведены результаты одного из опытов с дрожжами C. utilis, взятыми с агаризо-ванной поверхности питательной среды после 7 сут хранения (стационарная фаза роста) и культуры, активно растущей в жидкой питательной среде. Амплитуда сигналов спинового эха возрастает в несколько раз при переходе клетки от активного роста к состоянию пролиферативного покоя (стационарная фаза). При этом время релаксации Т2, характеризующее подвижность воды, оставшейся в клетках дрожжей, практически
КОРРЕЛЯЦИЯ ВЕЛИЧИНЫ ФРАКЦИИ подвижной воды
513
Рис. 1. Кривые спада амплитуды спинового эха лиофилизированных дрожжей C. utilis: стационарная фаза роста (1), фаза активного роста (2).
не меняется. По-видимому, подвижность этой воды на молекулярном уровне остается практически постоянной на разных фазах роста дрожжей.
Переход культуры дрожжей от одной фазы роста к другой обусловлен степенью обеспеченности питательными веществами и сопряжен с изменениями удельной скорости роста. Как видно на рис. 2, дрожжи достигают максимальной удельной скорости роста 0.54 ч-1 к 6-му ч культивирования, когда концентрация глюкозы в питательной среде снижается до 8 г/л, а затем быстро падает по мере исчерпания глюкозы. Величина ФПВ максимальна в клетках лаг-фазы, когда удельная скорость роста практически равна нулю (инокулят был взят из культуры стационарной фазы роста), а по мере увеличения удельной скорости роста снижается, и в клетках фазы логарифмического роста составляет лишь 0.25% от массы лиофилизированных клеток. Одновременно со снижением удельной скорости роста культуры величина ФПВ в клетках возрастает, т.е. эти показатели связаны обратной зависимостью. Это сопряжено, как было высказано р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.