МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 906-915
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.113.4:577.152.314.14
КОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ СуэШ МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ Ssoll С ДНК-ДУПЛЕКСАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ ФОСФОРИЛДИСУЛЬФИДНУЮ МЕЖНУКЛЕОТИДНУЮ ГРУППУ
© 2003 г. О. В. Воробьева, А. С. Романенков, В. Г. Метелев, А. С. Карягина1, Н. В. Лаврова1,
Т. С. Орецкая, Е. А. Кубарева*
Химический факультет и Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской
академии сельскохозяйственных наук, Москва, 127550 Поступила в редакцию 10.04.2003 г.
Для аффинной модификации остатка Суз 142 С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы (М.ХтоП) использованы ДНК-дуплексы, содержащие единичную фосфорилдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи. Продемонстрирована возможность получения конъюгатов модифицированных ДНК-дуплексов с М.ХтоП в результате реакции дисуль-фидного обмена. Эффективность реакции ковалентного присоединения М.ХтоП к ДНК зависит от первичной структуры дуплексов, места введения модификации и наличия Б-аденозил-Ь-гомоцисте-ина - нереакционноспособного аналога кофактора реакции метилирования. Полученные результаты свидетельствуют о сближенности сульфгидрильной группы Суз142 М.ХтоП с углеводофосфат-ным остовом в процессе связывания ДНК.
Ключевые слова: ДНК-белковые взаимодействия, С5-цитозиновые ДНК-метилтрансферазы, аффинная модификация, фосфорилдисульфидная межнуклеотидная группировка.
Реакция метилирования ДНК является одной из важнейших в биохимии клетки. У млекопитающих метилирование ДНК играет существенную роль в таких процессах, как регуляция генной экспрессии, импринтинг, эмбриональное развитие, ДНК-репликация, упаковка хроматина и возникновение онкогенных заболеваний. У прокариот метилирование ДНК тесно связано с процессами репликации и репарации ДНК, а также с регуляцией экспрессии генов [1-5]. В зависимости от типа субстрата ДНК-метилтрансферазы (МТазы) могут быть подразделены на МТазы, метилирующие экзоциклический атом азота цитозина (N4-цитозиновые МТазы) или аденина ^6-аденино-вые МТазы) и МТазы, метилирующие цитозин по С5-атому (С5-цитозиновые МТазы). С5-цитози-
Принятые сокращения: МТаза - ДНК-метилтрансфераза; ПААГ - полиакриламидный гель; РСА - рентгенострук-турный анализ; УДГ - урацил-ДНК-гликозилаза; фДСГ, pss - фосфорилдисульфидная группа; HEPES - 4-(2-гидро-ксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; M.-SsoII -ДНК-метилтрансфераза SioII; М.НаеШ - ДНК-метилтран-сфераза HaeIII; М.HhaI - ДНК-метилтрансфераза HhaI; R.-SsoII - эндонуклеаза рестрикции SsoII; SAM - S-адено-зил-Ь-метионин; SAH - S-аденозил-Ь-гомоцистеин; SDS -додецилсульфат натрия. При обозначении дезоксирибо-нуклеозидов, олигодезоксирибонуклеотидов и ДНК-дуплексов индекс d (дезокси) опущен. * Эл. почта: kubareva@belozersky.msu.ru
новые МТазы обнаружены как в прокариотах, так и в эукариотах. Как правило, бактериальные С5-цитозиновые МТазы узнают строго определенную последовательность ДНК и метилируют цитозин, расположенный внутри данной последовательности. Эукариотические С5-цитозиновые МТазы метилируют остатки цитозина в Срв динук-леотидах. Аминокислотные последовательности каталитических доменов бактериальных и эукарио-тических С5-цитозиновых МТаз характеризуются общей структурной организацией. Они включают 10 расположенных в строго определенном порядке высокогомологичных мотивов [1, 6].
К настоящему моменту получены данные РСА для двух прокариотических С5-цитозиновых МТаз, М.ИНа! и М.ЯаеШ [7-11]. Оба фермента состоят из двух доменов. Большой, каталитический домен, включающий в себя все 10 консервативных аминокислотных мотивов, формирует каталитический центр и центр связывания кофактора реакции метилирования - S-аденозил-Ь-метионина (SAM). Малый домен, расположенный между VIII и IX консервативными мотивами, ответствен за узнавание ДНК. Механизм реакции метилирования для С5-цитозиновых МТаз предполагает "выведение" метилируемого цитидина из двойной спирали ДНК и локализацию его в каталитическом "кармане" фермента [7]. Этот процесс сопровож-
M. SsoII 72 YRMI DL FAG I GGTRLGFHQT NAVNVVFSSE WDKFAQKTYH ANY.GDFPDG
M. Hhal 12 LRFIDLFAGL GGFRLAL.ES CGAECVYSNE WDKYAQEVYE MNF.GEKPEG
M. Haelll 1 MNLISLFSGA GGLDLGF.QK AGFRIICANE YDKSIWKTYE SNHSAKLIKG
j------------------ __ ы_------------ Ы1_
M. SsoII 121
M. Hhal 60 DITQVNEKTI PDHDILCAGF PCQAFSISGK QKGFEDSRGT LFFDIARIVR
M. HaeIII 50 DISKISSDEF PKCDGIIGGP PCQSWSEGGS LRGIDDPRGK LFYEYIRILK
----------------IV-----------------------у-------
M. SsoII 171 EKKPHAFLLE NVKNLLGHDK GRTFSIIKNT LEELNYTVYY NIFAAKDFGV
M. HhaI 110 EKKPKVVFME NVKNFASHDN GNTLEVVKNT MNELDYSFHA KVLNALDYGI
M. HaeIII 100 QKKPIFFLAE NVKGMMAQRH NKAVQEFIQE FDNAGYDVHI ILLNANDYGV
VI----------------VII--- VIII-----
M. SsoII 221 PQNRERIYIV GFNKEKVRNH M. HhaI 160 PQKRERIYMI CFRNDLNIQ. M. HaeIII 150 AQDRKRVFYI GFRKELNI. .
EHFTFPTPLK TKTRVGDILE KSVDNKYTLS .NFQFPKPFE LNTFVKDLLL PDSEVEHLVI .NYLPPIPHL IKPTFKDVI. WDLKDNPIPA
M. SsoII 271 DALWNGHQR. M. HhaI 208 DRKDLVMTNQ M. HaeIII 196 LDKNKTNGNK
.......RKL VNAAAGKGFG
EIEQTTPKTV RLGIVGKGGQ CIYPNHEYFI GSYSTIFMSR
YGLFNENSPY TNTISAR... GERIYSTRGI AITLSAY... .NRVRQWNEP AFTVQASGRG
M. SsoII 313 YYKDGSEILI EQKGSNP...........RK ITPREASRLQ GFPSDFIIP.
M. HhaI 255 GGGIFAKTGG YLVNGKT...........RK LHPRECARVM GYPDSYKVH.
M. HaeIH 246 CQLHPQAPVM LKVSKNLNKF VEGKEHLYRR LTVRECARVQ GFPDDFIFHY
IX---------------
M. SsoII 349 379
M. HhaI 293 PSTSQAYKQF GNSWINVLQ YIAYNIGSSL NFKPY. 327 M. HaeIII 296 ESLNDGYKMI GNAVPVNLAY EIAKTIKSAL EICKGN 330
X-_----------------
Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей М.55оП, Ы.ИкаI и М.ИавШ. В выравнивании отсутствуют негомологичные М-концевые участки, соответствующие 71-му и 11-ти аминокислотным остаткам М.5^^11 и М.Ика! соответственно. Аминокислотные остатки, обсуждаемые в тексте, выделены жирным шрифтом.
дают значительные конформационные перестройки в структуре фермента. В частности, петля каталитического домена, содержащая консервативный Cys (мотив IV; Cys81 в M.HhaI), разворачивается по направлению к ДНК и фиксирует этот аминокислотный остаток в каталитическом центре. Остаток Cys фермента оказывается пространственно сближенным с метилируемым ци-тозином. Протонирование N3-атома цитозина, осуществляемое остатком Glu (мотив VI; Glu119 в M.HhaI), облегчает нуклеофильную атаку С6-атома цитозина Cys-тиолатом. В образовавшемся ковалентном интермедиате С5-атом цитозина приобретает дополнительный отрицательный заряд, и, как следствие, происходит его алкилирова-ние метильной группой SAM. Последний переходит в нереакционноспособный S-аденозил-Ь-гомо-цистеин (SAH). Удаление протона при С5-атоме метилированного цитозина приводит к распаду ко-валентного ДНК-белкового интермедиата и восстановлению ароматичности модифицированного гетероциклического основания [7, 10, 12]. Указанный механизм и существенная роль цистеина в ка-
тализе реакции метилирования ДНК подтверждены большим числом биохимических исследований [7, 8, 13-17]. Все известные к настоящему времени С5-цитозиновые МТазы содержат остаток Су8, входящий в состав высококонсервативного дипептида РгоСу8 (мотив IV) (рис. 1).
Вышинский и соавт. [13] показали, что остаток Су8 (РгоСу8, мотив IV), столь необходимый для катализа, не вовлечен в специфическое узнавание МТазами участка метилирования в ДНК. Однако вопрос о роли Су8 в процессе связывания ДНК в целом остался открытым. Не исключено участие данного аминокислотного остатка во взаимодействии с углеводофосфатным остовом ДНК. Для выяснения этого вопроса в настоящей работе предложено использовать ДНК-дуплексы, содержащие единичную фосфорилдисуль-фидную межнуклеотидную группу (ФДСГ) вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотид-ной связи. Ранее были описаны синтез и свойства ДНК-дуплексов подобной структуры, особенности их взаимодействия с тиолсодержащими соеди-
нениями, включая аминокислоты, пептиды и белки, по механизму дисульфидного обмена [18-20].
В настоящей работе изучено ковалентное связывание прокариотической С5-цитозиновой МТазы SsoII (М.&уоП) с ФДСГ-содержащими ДНК-дуплексами. Полученные результаты свидетельствуют о сближенности сульфгидрильной группы аминокислотного остатка Cys142 фермента с уг-леводофосфатным остовом на стадии связывания ДНК.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Синтез олигодезоксирибонуклеотидов. Оли-гонуклеотиды, использованные в настоящей работе, получены амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе Applied Biosystems 380B (США) по стандартному регламенту. Олиго-нуклеотиды, содержащие фосфорилдисульфи-дную межнуклеотидную группу, синтезировали, как описано в работе [20].
Ферменты и химические реагенты. Т4-поли-нуклеотидкиназа (10 ед.акт./мкл) и урацил-ДНК-гликозилаза (50 ед.акт./мкл) - коммерческие препараты производства ООО "СибЭнзим" (Новосибирск). Препараты эндонуклеазы рестрикции SsoII (60 ед.акт./мкл) и метилтрансферазы SsoII (10 ед.акт./мкл) выделены по двухстадийной схеме, включающей хроматографию на гепарин-се-фарозе и Ni-NTA-агарозе [21].
В работе использовали S-аденозил-Ь-гомоцис-теин фирмы "Sigma" (США), у-Ь-глутамил-Ь-цис-теинилглицин (глутатион), ^-ацетил-Ь-лизин фирмы "ICN" (США).
Взаимодействие ФДСГ-содержащих ДНК-дуплексов с глутатионом. К 2.5 нмоль ФДСГ-со-держащего ДНК-дуплекса добавляли 30 мкл 0.25 мМ раствора глутатиона в буфере А (7.5 мМ HEPES, рН 8.0, 34 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0.05 мМ EDTA). Реакционную смесь инкубировали при 25°C в течение 1 ч. Олигонуклеотидный материал высаживали 5-кратным избытком 2%-ного раствора LiClO4 в ацетоне, промывали ацетоном и сушили на воздухе. Затем препараты растворяли в 5 мкл смеси формамид : вода (4 : 1), содержащего красители-маркеры бромфеноловый синий (BPB) и ксиленцианол (XC) (0.01% в/о), и анализировали с помощью электрофореза в 20%-ном ПААг, содержащем 7 М мочевину, в ТБЕ-буфере (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ H3BO3, 1 мМ EDTA
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.