Криоконсервация и сохранение биоразнообразия
С.Я.Амстиславский, Т.О.Абрамова, Е.Ю.Брусенцев, Е.А.Кизилова
Один из побочных эффектов развития цивилизации — обеднение генофонда и в конечном счете гибель и исчезновение многих видов растений и животных. Возрастание численности населения, уже перевалившей за 7 млрд, неизбежно приводит к расширению сферы хозяйственной деятельности людей, охватывающей все новые территории под распашку полей, строительство промышленных объектов, прокладывание дорог и т.д. Пространства многих природных экосистем стремительно сокращаются, изменяются и разрушаются места обитания диких животных и растений, уменьшаются их численность и разнообразие. Эти процессы приняли особенно угрожающие масштабы с конца XX в.
В мире существует около 5400 видов млекопитающих, причем, по данным Международного союза охраны природы, более 20% из них находятся под угрозой исчезновения. Наиболее яркий пример животных, нуждающихся в помощи, — семейство кошачьих (Felidae). В нем из 37 процветает лишь один вид — домашняя кошка (Felis catus), а остальные 36 диких (среди которых есть несколько весьма крупных хищников, венчающих пищевые цепочки) постепенно вымирают. Как правило, исчезают конкретные подвиды, а их родственники «стоят в очереди». Например, из восьми подвидов тигра (Panthera tigris) сохранилось всего пять (нет больше туранского, яванского и балийского), но и их положение нельзя назвать стабильным. С пиренейской рысью (Lynx pardinus) ситуация еще более угрожающая — это один из самых малочисленных видов млекопитающих на планете.
Обеспокоенность этой проблемой побуждает ученых искать способы сохранения биоразнообразия, как внутри-, так и межвидового. Первый традиционный подход заключается в поддержании жизнеспособных популяций in situ (в местах обитания) — создаются благоприятные условия для их существования в природе и проводятся охранные мероприятия. Второй основан на разведе-
© Амстиславский С.Я., Абрамова Т.О., Брусенцев Е.Ю., Кизилова Е.А., 2014
нии видов, точнее, небольших популяций ex situ (вне их мест обитания) — в зоопарках, питомниках и т.д. К сожалению, несмотря на отдельные достижения, эти традиционные подходы не могут существенно затормозить негативную тенденцию, особенно по отношению к крупным млекопитающим. Охраняемым территориям, например, трудно сравняться по площади с естественными охотничьими угодьями тигра. Содержание же в зоопарках и на фермах приводит к тому, что животные адаптируются к неволе и возникают большие сложности при их возвращении в дикую природу.
Успешное развитие криобиологии, изучающей воздействие низких температур на живые организмы, в сочетании с искусственной репродукцией привело к появлению новых перспективных способов, позволяющих сохранить многообразие млекопитающих. Эти методы хорошо комбинируются с традиционными природоохранными подходами и разведением в неволе.
Замораживание гамет и эмбрионов
Современная биология развития позволяет преодолеть экологические, поведенческие и даже межвидовые барьеры с помощью искусственного осеменения или трансплантации эмбрионов (введения семени или эмбрионов в репродуктивные пути специально подготовленных самок). С помощью репродуктивных технологий можно осуществить процесс оплодотворения экстракорпорально (т.е. вне тела), клонировать животных и создавать химеры (организмы, состоящие из генетически разнородных клеток), в том числе межвидовые. Более того, в комплексе с методами криобиологии удается даже получить живое потомство от мертвых животных [1].
Один из методов репродуктивной биологии, имеющий прямое отношение к сохранению генетических ресурсов, — криоконсервация, т.е. низкотемпературное хранение живых объектов с возможностью последующего восстановления их биологических функций. В научной литературе
Сергей Яковлевич Амстиславский (крайний справа), доктор биологических наук, заведующий сектором криоконсерва-ции и репродуктивных технологий Института цитологии и генетики (ИЦиГ) Сибирского отделения РАН. Область научных интересов — криобанки эмбрионов и гамет для сохранения биоразнообразия, влияние репродуктивных технологий на проявление генетически обусловленных свойств потомков.
Татьяна Олеговна Абрамова (вторая справа), кандидат биологических наук, младший научный сотрудник того же сектора. Занимается молекулярно-биологическими исследованиями преимплантационных эмбрионов млекопитающих и потомков, родившихся в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий.
Евгений Юрьевич Брусенцев, аспирант того же сектора. Область научных исследований — адаптация репродуктивных технологий к различным видам млекопитающих, изучение репродуктивных барьеров и способов их преодоления, а также отдаленных эффектов длительного культивирования эмбрионов in vitro.
Елена Александровна Кизилова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики развития того же института, ассистент кафедры цитологии и генетики факультета естественных наук Новосибирского государственного университета. Научные интересы связаны с ранним развитием млекопитающих, химеризмом, криобанками, эмбриотоксикологией и тератогенезом, сохранением биоразнообразия ex situ, стволовыми клетками.
термин «криоконсервация» чаще всего означает хранение биологических объектов в течение некоторого времени при температуре жидкого азота (-196°С), считающееся успешным, только если они полностью жизнеспособны после размораживания. Хранилище замороженного биоматериала называется криобанком (рис.1). К нему также относится и комплекс оборудования для осуществления глубокого замораживания и «оживления» образцов по специальной технологии. В современных криобанках в замороженном виде сох-
раняют мужские и женские гаметы (сперматозоиды и ооциты, или яйцеклетки) и образующиеся в результате их слияния (оплодотворения) ранние эмбрионы. Криобанки широко используются для сохранения генетических ресурсов лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также исчезающих видов млекопитающих.
Важнейшее для крио- и репродуктивной биологии событие произошло в 1949 г., когда английские ученые О.Смит и К.Полдж случайно обнаружили криопротекторные (защищающие от повреждений, вызываемых замораживанием) свойства глицерина. Они показали, что под его защитой сперматозоиды могут переживать охлаждение до температуры жидкого азота. Кстати, глицерин до сих пор остается одним из лучших криопротекторов. После опубликования этих результатов наступила «эра искусственного осеменения» в животноводстве — во многих странах стали использовать замороженное семя для размножения крупного рогатого скота. В настоящее время при температуре жидкого азота сохраняют сперматозоиды большинства лабораторных и сельскохозяйственных животных, кроме того, семя более чем 60 диких видов млекопитающих подвергалось криокон-сервации. Именно замороженные образцы семени составляют основу банков генетических ресурсов диких млекопитающих в ряде стран мира [2].
При слиянии мужской и женской гамет образуется зигота (оплодотворенная яйцеклетка), которая начинает дробиться. Стадии раннего развития зародыша до его внедрения в матку называют преимплантационны-ми. Первое успешное замораживание таких эмбрионов млекопитающих (мышей) было независимо осуществлено в Великобритании в начале 1970-х годов группами Д.Уиттингема и Я.Уил-мута. Вскоре практически для всех лабораторных и домашних
Рис.1. Институтский криобанк, в котором хранится более 4000 эмбрионов мышей, крыс и хомяков, а также семя этих видов грызунов и двух видов кошачьих. На этапе хранения биоматериала нужны лишь небольшое помещение и жидкий азот в специальных сосудах, оснащенных системами автоматического мониторинга и пополнения азотом. Полезно распределять материал по двум или более хранилищам, на случай если в одном из них возникнет аварийная ситуация.
Здесь и далее фото авторов (за исключением указанных случаев)
животных был разработан способ замораживания эмбрионов. Преимплантационные зародыши уже более чем 40 видов млекопитающих, среди которых мало диких представителей, подвергались криоконсервации [3]. Трансплантируя эмбрионы, взятые из криобанка, из отряда хищных (Carnivora) живое потомство получали от домашней кошки, собаки (Canis familiaris) и разводимого на фермах лесного хорька (Mustela putorius), а также от нескольких видов диких кошек — степной (Felis libyca), оцелота (Leopardus pardalis) и каракала (Caracal caracal). В силу биологических особенностей эмбрионы хищных сложно замораживать, к тому же среди них много редких и исчезающих видов, что делает сам процесс получения биоматериала затруднительным.
Через несколько лет после успеха с эмбрионами в лаборатории Уиттингема были получены положительные результаты по замораживанию ооци-тов мышей. Криоконсервация яйцеклеток большинства видов млекопитающих, в отличие от замораживания сперматозоидов и эмбрионов, до сих пор чрезвычайно проблемна. Поэтому генетические ресурсы животных гораздо чаще сохраняют в виде именно эмбрионов или сперматозоидов, а не ооцитов [4, 5]. Однако технологии криокон-сервации яйцеклеток интенсивно разрабатываются, и, например, в случае человека в последнее десятилетие был достигнут существенный прогресс
[6]. Одна из основных проблем, возникающих при замораживании женских гамет, — затвердевание прозрачной оболочки. Эта эластичная гликопро-теиновая преграда вокруг яйцеклетки отделяет ее от окружающей среды. После слияния со сперматозоидом в ооците запускается каскад биохимических реакций, который вызывает выброс наружу содержимого кортикальных гранул — мембранных пузырьков с литическими ферментами. Они модифицируют прозрачную оболочку, которая преобразуется в так называемую оболочку оплодотворения, препятствующую полиспермии — проникновению в яйцеклетку более одного сперматозоида. Процессы замораживания/размораживания приводят к опорожнению кортикальных гранул, затрудняя или делая вовсе невозможным последующее оплодотворение таких ооцитов [7]. Другая не менее серьезная проблема заключается в том, что овулировавшие (вышедшие из фолликулов в фаллопиевы трубы) яй
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.