ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 430, № 4, с. 559-561
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.112.9.014.43
КРИОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА РЯДА ПЕКТИНОВ
© 2010 г. О. Н. Соломина, Е. П. Сведенцов, О. О. Зайцева, Т. В. Полежаева, Р. Г. Оводова, В. В. Головченко, Д. С. Лаптев, А. Н. Худяков, Е. С. Степанова, академик Ю. С. Оводов
Поступило 28.07.2009 г.
Ранее нами было показано, что под защитой хладоограждающего раствора, в состав которого введен лемнан, пектин ряски малой (Lemna minor L.) [1, 2], сохраняется функциональная активность лейкоцитов крови человека, подвергнутых гипобиозу (—10°С) до 3 сут [3].
В данной работе исследована способность отличающихся по строению и физико-химическим свойствам от лемнана физиологически активных пектиновых полисахаридов оказывать в составе хладоограждающих растворов для лейкоцитов, хранившихся в условиях субумеренно низкой температуры (—20°С), криопротекторное действие. К таким пектиновым полисахаридам относятся комаруман — пектин сабельника болотного Comarum palustre L.; потамогетонан — пектин рдеста плавающего Potamogeton natans L.; апи-уман — пектин сельдерея пахучего Apium graveo-lens L. и бергенан — пектин бадана толстолистного Bergenia crassifolia L.
В состав комарумана входят участки линейного и разветвленного 1,4-а-^-галактопиранозилу-ронана, а также рамногалактуронана-I (RG-I) с боковыми цепями, состоящими из 1,4-р-связан-ных остатков ^-галактопиранозы [4]. Углеводная цепь потамогетонана представлена линейным 1,4-а-^-галактопиранозилуронаном [5]. Главным структурным компонентом апиумана является высокометилэтерифицированный линейный 1,4-а-^-галактопиранозилуронан [6]. Бергенан вместе с линейным 1,4-а-^-галактопиранозилурона-ном в качестве минорного структурного элемента имеет незначительные области разветвленного RG-I [7]. Ранее было показано, что все исследованные пектиновые полисахариды обладают им-муномодулирующим действием [1, 2, 4—6].
Объектом исследования был концентрат лейкоцитов (ЛК), выделенный с информированного согласия из цельной крови у 30 доноров-добровольцев путем цитафереза. Среднее количество
Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской Академии наук, Сыктывкар
ЛК составляло 15 мл. Выполнено шесть экспериментальных серий (в каждой по 10 исследований). В первой серии (контроль) ЛК замораживали под защитой раствора, включающего глицерин (эндоцеллюлярный криопротектор), трилон В (антикоагулянт) и гидроксид натрия (для доведения рН раствора до физиологической нормы 7.0—7.4). Со второй по шестую серии в контрольный раствор дополнительно вводили один из пектинов: апиуман, бергенан, комаруман, лемнан, потамогетонан соответственно. Перед замораживанием ЛК смешивали в соотношении 1 : 1 с одним из шести вариантов криозащитного раствора в пла-стикатном контейнере "Компопласт 300" и выдерживали в течение 20 мин при комнатной температуре. Замораживание клеток производили в течение 15 мин по двухступенчатой экспоненциальной программе: на первом этапе со скоростью 10°С/мин до точки эвтектики (—2.1 °С), на втором — 2—3°С/мин до температуры —20°С в спиртовой (96%-ный этиловый спирт) ванне камеры электроморозильника "Криостат". Быстрое размораживание ЛК осуществляли через 24 ч в 20-литровой водяной ванне, нагретой до 38°С, в течение 35—50 с (в зависимости от объема биообъекта) при интенсивном покачивании контейнера. Количество лейкоцитов подсчитывали в камере Го-ряева, морфологический состав — путем подсчета лейкоформулы. Оценку жизнеспособности лейкоцитов проводили в пробах исключения витального красителя эозина [8], фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по модифицированному методу Потаповой и соавт. [8]. Изучение содержания в гранулах соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофилов без участия кислорода, проводили с помощью лизосо-мально-катионного теста по методу Славинского и Никитиной [9].
Полученные данные обрабатывали статистически: вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. Достоверность различия между показателями оценивали по критерию Уилкоксона [10]. Результаты считали достоверными прир < 0.05.
560
СОЛОМИНА и др.
Таблица 1. Показатели лейкоцитных концентратов, замороженных до субумеренно низкой температуры (—20°С) и хранившихся под защитой криопротекторных сред с различными пектинами в течение 1 сут (п = 10, М ± ст)
Экспериментальная серия
До замораживания
После отогрева
После размораживания, % от уровня до замораживания
1 2
3
4
5
6
1 2
3
4
5
6
1 2
3
4
5
6
1 2
3
4
5
6
Количество лейкоцитов в 1 мкл
13870: 16760: 15140:
3633 6172 1819
18470±6136 17390 ± 1304 13150± 1231
12850± 4417 14910±6404 11710±3193 16980±5698 15180±2516# 11130± 1213#
Количество эозинорезистентных лейкоцитов, %
99.1 ± 0.9 99.7 ± 0.5 98.7 ± 1.6 99.0 ± 1.4 97.9 ± 2.0 99.6 ± 1.0
75.0 ± 8.2#
74.5 ± 17.4#
79.6 ± 8.7# 82.5 ± 6.8# 76.5 ± 6.8# 76.9 ± 8.9#
Количество нейтрофилов, %
30.7 ± 3.3
49.3 ± 7.7
27.7 ± 3.5 49.6 ± 8.6
48.8 ± 11.1
48.4 ± 8.8
18.4 ± 6.2# 25.6 ± 7.8# 18.8 ± 3.0# 45.1 ± 9.6# 20.0 ± 6.9# 24.8 ± 5.9#
86.4 81.1
89.0 90.6 88.9
87.6
75.5 74.9
80.7
83.1 78.0
77.2
50.8 47.0 70.7 68.0 52.2 51.2
13.4
11.4 6.8 7.9
10.5 8.1
8.3 17.5 3.7 : 6.6* 6.7 8.7
11.9 13.5 : 6.4* : 13.5* 11.9 10.7
Количество фагоцитарно активных нейтрофилов, %
92.0 ± 3.1 65.0 ± 0.0 89.7 ± 5.4 55.3 ± 3.9 51.6 ± 14.1 74.2 ± 9.4
Разрушена плазматическая Разрушена плазматическая 14.0 ± 1.5# 38.2 ± 4.4# 40.6 ± 3.7# Разрушена плазматическая
мембрана мембрана
15.4 ± 1.5 69.1 ± 8.7
80.5 ± 16.2 мембрана
Содержание лизосомально-катионных белков гранул нейтрофилов, у.е.
1 2.8 ± 0.1 2.3 ± 0.4# 81.3 ± 13.2
2 2.9 ± 0.1 2.7 ± 0.2 94.5 ± 2.1*
3 2.4 ± 0.2 1.7 ± 0.6# 57.4 ± 6.3*
4 2.6 ± 0.1 2.5 ± 0.2 95.9 ± 4.4*
5 2.2 ± 0.3 1.7 ± 0.5 74.6 ± 9.7
6 2.7 ± 0.1 2.6 ± 0.2 95.7 ± 4.5*
Пектины введены в следующие серии: 2—апиуман, 3—бергенан, 4—комаруман, 5—лемнан, 6—потамогетонан.
# Различия с данными до замораживания достоверны (р < 0.05).
* Различия с данными серии 1 достоверны (р < 0.05).
Установлено (табл. 1), что после выхода из криоанабиоза —20°С через одни сутки как в контрольной, так и опытных сериях в ЛК число сохранившихся лейкоцитов достоверно не изменя-
ется. Однако при изучении устойчивости мембран клеток к эозину выявлено, что она по сравнению с контрольной серией достоверно выше в присутствии комарумана. Оценка сохранно-
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 430 № 4 2010
КРИОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА
561
сти нейтрофилов как самых чувствительных клеток среди лейкоцитов к действию холодового стресса показала, что наиболее эффективно справляются с этой задачей растворы, содержащие комаруман и бергенан.
Проведенный анализ фагоцитарной активности нейтрофилов показал, что в контрольной серии и при использовании в растворах апиумана (вторая серия) и потамогетонана (шестая серия) клетки после размораживания не выдерживают термостатирования и их плазматические мембраны разрушаются. В связи с этим фагоцитарную активность нейтрофилов удалось оценить только в трех сериях: в присутствии бергенана, где этот показатель ниже 50%, что неприемлемо в гематологической практике; в присутствии комарумана и лемнана, где поглощение частиц латекса после отогрева через одни сутки сохраняется на высоком уровне.
При определении содержания лизосомально-катионного белка в гранулах нейтрофилов в сравнении с контрольной серией выявлено его достоверное снижение в клетках, смешанных с раствором, содержащим бергенан, тогда как во второй, четвертой и шестой сериях отмечается повышенное содержание белка.
Показано (табл. 1), что в условиях субумеренно низкой температуры (—20°С) наиболее выраженными криопротекторными свойствами для ядерных клеток крови человека обладает комару-ман, способствующий сохранению плазматической мембраны нейтрофилов, их высокой фагоцитарной активности и устойчивости мембран гранул к холодовому стресс-воздействию, что
скорее всего связано с наличием в составе его углеводной цепи значительных разветвленных областей [4]. Ранее было показано, что лемнан, в состав макромолекулы которого также входят значительные разветвленные участки [1], подобно комаруману повышает устойчивость мембран гра-нулоцитов к холодовому стресс-воздействию [3].
Авторы выражают благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за оказанную финансовую поддержку при выполнении данной работы (грант РФФИ 08-04-01423).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. // Phytochemistry. 2002. V. 60. P. 89-97.
2. Оводова Р.Г., Головченко В.В., Шашков А.С. и др. // Биоорган. химия. 2000. Т. 26. С. 743-751.
3. Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Оводова Р.Г. и др. // ДАН. 2008. Т. 421. № 4. С. 559-561.
4. Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Шашков А.С. и др. // Биохимия. 2005. Т. 70. В. 8. С. 1051-1062.
5. Popov S.V., Popova G.Yu, Paderin N.M. и др. // Phy-tother. Res. 2007. V. 21. P. 609-614.
6. Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Popov S.V. и др. // Food Chem. 2009. V. 114. P. 610-615.
7. Головченко В.В., Бушнева О.А., Оводова Р.Г. и др. // Биоорган. химия. 2007. Т. 33. № 1. С. 54-63.
8. Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Худяков А.Н. и др. // Биол. мембраны. 2008. Т. 25. № 1. С. 23.
9. Славинский А.А., Никитина Г.В. // Клин. лаб. диагностика. 1999. № 2. С. 35-37.
10. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. 459 с.
9 ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 430 № 4 2010
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.