ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2007, том 54, № 1, с. 137-143
ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ
УДК 581.1
КРИОСОХРАНЕНИЕ СЕМЯН И ПРОТОКОРМОВ РЕДКИХ ОРХИДЕЙ УМЕРЕННОГО КЛИМАТА
© 2007 г. Т. В. Никишина*, Е. В. Попова*, М. Г. Вахрамеева**, Т. И. Варлыгина**, Г. Л. Коломейцева***, А. В. Буров****, Е. А. Попович*,
А. И. Широков****, В. Ю. Шумилов *, А. С. Попов*
*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва ***Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, Москва ****Центр реинтродукции редких видов и растительных сообществ, Н.-Новгород
Поступила в редакцию 21.03.2006 г.
Исследовали эффективность криосохранения семян 5 видов редких и исчезающих видов орхидей (родов Platanthera и Dactylorhiza) умеренной полосы с последующим асимбиотическим культивированием in vitro, а также культивируемых in vitro протокормов D. fuchsii. Всхожесть семян после их хранения в жидком азоте зависела от вида и могла быть как выше, так и ниже, чем у контрольных, не подвергавшихся замораживанию семян. Скорость роста протокормов (зародышей орхидных на начальной фазе развития после освобождения от семенной кожуры) из семян одних и тех же видов орхидей, собранных в разных областях России, достоверно не различалась в течение 5 мес. культивирования. После глубокого замораживания протокормов D. fuchsii размером 1200 мкм методом витрификации были получены живые протокормы, однако их рост запаздывал на 3 мес. по сравнению с контрольными протокормами.
Dactylorhiza - Platanthera - орхидеи - криосохранение семян и протокормов - культура in vitro
ВВЕДЕНИЕ
Крупнейшее (20000-35000 видов) сем. ОгсЫ-daceae Juss., несмотря на многочисленность и распространенность его представителей по всей нашей планете (за исключением полярной зоны), практически целиком включено в Красные книги разных стран, так как находится под угрозой вымирания [1]. Участники XVI Международного конгресса ботаников (США, 1999 г.) пришли к выводу, что из примерно 300000 видов высших растений, произрастающих в настоящее время на Земле, к середине нынешнего века может исчезнуть от 1/2 до 2/3. Если 18 лет назад из 123 видов орхидей в Российской Красной книге было 44, то в настоящее время в Перечень редких видов включено 66 видов (Приказ МПР РФ № 289 от 25.10.2005), и некоторым из них угрожает полное исчезновение [1].
Сокращения: ГСД - раствор криопротекторов для медленного замораживания; ДМСО - диметилсулфоксид; LS - нагружающий раствор (от Loading Solution); PVS2 - раствор для витрификации 2 (от Plant Vitrification Solution 2). Адрес для корреспонденции: Попов Александр Сергеевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: cryo@ippras.ru
Причиной возникновения такой ситуации послужили, с одной стороны, уязвимость орхидей, которые имеют сложную биологию размножения - узкоспециализированное перекрестное опыление; облигатный симбиоз с мицелием гриба определенного вида, необходимый для прорастания микроскопических зародышей, лишенных запасных веществ; длительный цикл развития (до 17 лет). С другой стороны, мощный антропогенный пресс (уничтожение мест их обитания и др.) [2, 3]. Все орхидеи имеют очень декоративные цветки. Кроме этого, у многих орхидей умеренного климата подземные органы обладают целебными свойствами, что хорошо известно местному населению, которое активно их использует [4, 5]. Некоторые орхидеи, например, Dactylorhiza fuch-sii фгисе) Soo, содержат ценные лекарственные вещества, используемые при лечении различных заболеваний, в листьях [5, 6]. Этот вид распространен в северной половине Евразии, хотя повсюду очень редок. По сравнению с другими орхидеями он рано переходит к цветению - уже через 4-5 лет после посева семян, и способен существовать в культуре продолжительное время, гораздо дольше, чем другие виды рода Dacty-¡огЫ2а [7, 8]. На примере этого вида можно отрабатывать различные способы сохранения генофонда орхидей и преодолевать сложности,
Таблица 1. Состав среды Fast в модификации Бурова
Компонент
Концентрация
Макроэлементы, мг/л
NH4NO3 KH2PO4
Ca(NO3)2 ■ 4H2O KCl
MgSO4■7H2O Fe-ЭДТА
160 80 80 160 80 16
Микроэлементы (по Хеллеру), мг/л MnS04 ■ 4H2O 0.1
CuSO4 ■ 5H2O 0.03
KI 0.01
Al2(S04)3 ■ 18H2O 0.074
NiS04 ■ 7H2O 0.035
Органические добавки, г/л
Дрожжи пивные 2
Активированный уголь 2
Сахароза 12
Фруктоза 5
неизбежно возникающие при работе с видами со слабо и трудно прорастающими семенами, т.е. он может быть использован как удобный модельный объект.
Сохранение орхидей в принципе возможно через культуру in vitro: для ряда видов уже разработаны способы асимбиотического проращивания семян, однако семена этих растений плохо хранятся даже в холодильнике [9-11]. Кроме того, поддержание коллекции in vitro очень трудоемко, и в процессе культивирования в растительном материале происходит накопление сомаклональных вариаций и непроизвольная селекция [12]. Выбор особей для дальнейшего культивирования обычно определяется по фенотипу, отбор же растений с определенным фенотипом неизбежно приводит к обеднению генофонда в целом. Поэтому, чем дольше поддерживается в культуре in vitro популяция, отобранная из гетерогенного посева, тем более гомогенной она становится [13].
Проблема надежного и неограниченно длительного хранения ортодоксальных семян с наименьшими затратами и на минимальной площади решается в криобанке (жидкий азот, -196°С). В 1979 г. для спасения исчезающих видов в дополнение к традиционным способам было предложено хранить семена, апексы, эмбриоиды и клетки, культивируемые in vitro и способные регенерировать растения, в жидком азоте [14]. Криобанки семян сельскохозяйственных культур и их дикорас-
тущих сородичей существуют в развитых странах уже около 40 лет.
Исследования криосохранения семян редких дикорастущих видов впервые в нашей стране начала Тихонова [15], и с 1986 г. ее коллекция находится в криобанке Института физиологии растений РАН [16-18]. Одновременно подобные исследования проводили Pritchard и др. на семенах некоторых орхидей [19, 20].
Влажность зрелых семян орхидных обычно менее 13%. Ранее мы успешно сохранили в криобанке семена редких тропических орхидей, прорастить которые в условиях in vitro оказалось легче, чем семена некоторых видов орхидей умеренного климата [11]. Наиболее быстро растущими из тропических видов оказались Calanthe vestita и Encyclia cochleata, полученные из семян, хранившихся в жидком азоте. После этого они уже цвели в оранжерее Главного ботанического сада РАН.
Цель данной работы состояла в том, чтобы разработать методику сохранения в криобанке семян и протокормов орхидей умеренной полосы, находящихся под угрозой исчезновения. Для этого проводили сравнительное изучение развития семян разной степени зрелости, собранных в разных регионах РФ, до и после глубокого замораживания.
МЕТОДИКА
В работе использовали зрелые семена Platan-thera bifolia (L.) Rich, а также зрелые и незрелые семена орхидей рода Dactylorhiza, собранные в различных регионах России: D. fuchsii (Druce) Soo -на Звенигородской биостанции МГУ (Московская обл.), недозрелые семена (сбор через 35-40 суток после опыления), в Костромской обл., незрелые семена (сбор через 27 суток после опыления) и в питомнике центра реинтродукции Нижегородского ГУ (Н.-Новгород), зрелые семена; D. maculata (L.) Soo - в Керженском заповеднике (Нижегородская обл.), на сфагновом болоте; D. baltica (Klinge) Orlova - в Минской обл. (Белоруссия); D. incarnata (L.) Soo - в питомнике центра реинтродукции (Н.-Новгород) и P. bifolia (L.) Rich. -в Рязанской обл., на влажной опушке леса и в питомнике центра реинтродукции (Н.-Новгород). До опытов свежесобранные семена хранили в холодильнике при 5-6°C в течение 2-3 мес. Влажность семян (D. fuchsii и D. incarnata) рассчитывали после их высушивания при 90°C в течение 3 суток.
Протокормы D. fuchsii культивировали около 7 мес. при 23 ± 1°С, 2.6 клк и фотопериоде 16 ч на агаризованной среде Fast в модификации Бурова (неопубликованные данные) (табл. 1) либо без регуляторов роста, либо с добавлением 0.1 или 1.0 мг/л бАп. Измеряли наибольший диаметр протокормов, число протокормов с апикальной
Таблица 2. Характеристика и всхожесть семян, собранных в разных регионах России
Вид растения Регион сбора семян Длина семени, мкм Длина зародыша, мкм Количество семян без зародышей, % Всхожесть семян на 60-е сутки, % Индекс роста**
Dactylorhiza fuchsii Костромская обл.* 936 ± 43 212 ± 8 15 60.0 19.5
(Druce) Soo Московская обл.* 600 ± 41 140 ± 10 40 40.3 19.3
Н.-Новгород 846 ± 20 208 ± 8 40 36.2 10.1
Platanthera bifolia Рязанская обл. 690 ± 26 180 ± 8 50 24.3 13.7
(L.) Rich. Н.-Новгород 713 ± 19 188 ± 6 45 48.9 16.0
* Незрелые семена.
** Индекс роста - отношение среднего диаметра протокормов к исходному диаметру зародышей на 150-е сутки культивирования.
почечкой и число почкующихся протокормов, а также длину ростков и диаметр псевдобульб.
Криосохранение семян. Зрелые семена замораживали в полиэтиленовых ампулах, быстро погружая их прямо в жидкий азот. Незрелые семена в данной работе не замораживали. Ампулы с семенами хранили в криобанке 30 суток. Оттаивание проводили в водяной бане при 40°С в течение 60 с. Перед посевом контрольные (не подвергавшиеся замораживанию) и опытные семена стерилизовали 5%-ным раствором гипохлорита кальция в течение 20-40 мин с последующей трехкратной отмывкой в дистиллированной воде по 5-15 мин. Нераскрывшиеся коробочки с незрелыми семенами протирали 70%-ным спиртом и обжигали в пламени спиртовки. Семена высевали в чашки Петри диаметром 9 см на агаризованную безгормональную среду МС [21] с половинной концентрацией макроэлементов, 20 г/л сахарозы, 0.7% агара, рН 5.5. Семена проращивали при 26 ± 1°С в темноте. Через 2-3 мес. подсчитывали образовавшиеся из зародышей протокормы, пересаживали их на свежую агаризованную среду того же состава и переносили в камеру с освещенностью 2.6 клк, фотопериодом 16 ч, температурой 25 ± 1°С и влажностью 70%.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.