КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2008, том 53, № 1, с. 145-148
РОСТ КРИСТАЛЛОВ
УДК 548.5:548.733
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКА ЛИЗОЦИМА В ПРЕЦИЗИОННО-УПРАВЛЯЕМОМ ГРАДИЕНТЕ ТЕМПЕРАТУРЫ
© 2008 г. В. И. Стрелов, Б. Г. Захаров, И. Ж. Безбах, Н. И. Сосфенов*
Научно-исследовательский центр "Космическое материаловедение" Института кристаллографии РАН,
Калуга
E-mail: zakharov@kaluga.rosmail.com * Институт кристаллографии РАН, Москва Поступила в редакцию 30.06.2006 г.
На основе результатов математического моделирования, на примере кристаллизации белка лизоци-ма, исследована возможность управления процессом кристаллизации биоматериалов с помощью температуры. Показано, что прецизионное управление температурой с созданием в растворе локального температурного градиента позволяет выращивать кристаллы лизоцима с высоким структурным совершенством.
PACS: 81.10.Dn, 87.15.Nn
ВВЕДЕНИЕ
Выбор условий кристаллизации белков в настоящее время проводится исключительно эмпирически, путем постановки многочисленных проб в различных условиях (скрининг) [1,2]. При этом работа крайне затрудняется тем обстоятельством, что начало кристаллизации (образование зародышей) требует значительно большего пересыщения раствора белка, чем последующий рост образовавшихся зародышей. По этой причине огромное значение имеет поиск таких методов кристаллизации, которые позволяли бы оперативно управлять пересыщением белкового раствора, как в процессе зарождения, так и последующего разращивания кристаллов. В данной работе использовался метод управления пересыщением с помощью создания локального градиента температуры в растворе при прецизионном управлении температурой.
Цель работы - исследование возможности получения структурно совершенных биокристаллов путем управления процессом кристаллизации в капиллярах с помощью температуры, в отличие от обычно применяемого метода свободной диффузии [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для разработки метода управления кристаллизацией биоматериалов была разработана математическая модель температурно-управляе-мого процесса кристаллизации на примере кристаллов лизоцима [3]. При расчете использовались следующие параметры: В - коэффициент диффузии белка, р - плотность раствора, | - динамическая вязкость, р* - концентрация белка, рб - плот-
ность белка, £(Т - зависимость растворимости белка от температуры, которые были взяты из данных [4, 5].
В результате проведенных расчетов было показано, что при кристаллизации создание локального температурного градиента в капилляре не приводит к возникновению термогравитационной конвекции, и процесс определяется диффузионным режимом тепломассопереноса. На рис. 1 представлено схематическое изображение кристаллизационной ячейки с капилляром, для которой проводились расчеты.
На примере роста кристаллов лизоцима теоретически были исследованы три случая управления процессом кристаллизации. При этом показано, что при г1 = 18°С (температура в точке) и г2 = 32°С (температура раствора белка) кристаллизация имеет место, но пересыщение возрастает до а ~ 5, что является избыточным и может приводить не только к образованию многих зародышей, но и к их быстрому росту, что может отрицательно сказаться на структурном совершенстве выращиваемых кристаллов. При этом расчеты показывают, что значение выведенной в кристалл массы белка (в пересчете на один кристалл) т ~ 0.28 мг соот-
1 2
Рис. 1. Схематическое изображение кристаллизационной ячейки с капилляром: 1 - термостат, 2 - капилляр с раствором белка.
Рис. 2. Блок-схема автоматизированной системы роста кристаллов.
Рис. 3. Фотография ростовой камеры блока-кристаллизатора: 1 - капилляр, 2 - точка локального отвода тепла.
ветствует размерам (0.8 х 0.9 х 0.5 мм) образовавшегося в реальных экспериментах кристалла ли-зоцима [4]. Во втором случае при г1 = г2 = 32°С пересыщение не достигает значения, необходимого
для зародышеобразования (а = 1), и кристаллизации не происходит. В третьем же случае при ¿2 = 32°С увеличение температуры г1 (после зародышеобразования) позволяет предотвратить дальнейшее возрастание пересыщения и плавно понизить его до значений а > 1, необходимых для роста образовавшегося кристалла. При таком варианте проведения эксперимента можно управлять скоростью роста кристалла (выбирая оптимальные режимы роста), и следует ожидать получения кристаллов белка с высоким структурным совершенством. Таким образом, полученные в результате расчетов данные доказали возможность активного управления процессом кристаллизации биоматериалов в земных и соответственно в космических условиях (в отличие от роста в изотермических условиях) с помощью создания локального температурного градиента в растворе белка.
На основе полученных результатов разработан и изготовлен экспериментальный образец ростового блока-кристаллизатора для выращивания кристаллов биоматериалов с помощью управления температурой. В этой системе: 1) осуществляется стабилизация температуры раствора с точностью регулирования ±0.1°С в объеме капилляра с возможностью ее программируемого управления, 2) осуществлена возможность управления пересыщением белка в локальной точке капилляра за счет точечного подвода или отвода в этом месте тепла (т.е. создания в этом месте локального температурного градиента), что исключает возможность образования зародышей по всему объему раствора. На рис. 2 и 3 представлены соответственно блок-схема и фотография экспериментальной установки.
На экспериментальном блоке-кристаллизаторе в автоматическом режиме были проведены процессы выращивания кристаллов лизоцима. В кристаллизаторе в течение четырех суток были выращены кристаллы лизоцима размером ~(0.7-0.9) мм, представленные на рис. 4. Исходные составы растворов белка и осадителя: водный раствор лизоцима концентрации 50 мг/мл в буфере 0.1 М КаЛе, рН 4.6; и водный раствор осадителя КаС1 концентрации 8% в буфере 0.1 М КаЛе, рН 4.6.
Выращивание кристаллов в блоке-кристаллизаторе осуществлялось в стеклянном капилляре, относительно толстостенном, в сравнении с рентгеновским капилляром. По этой причине для осуществления структурного исследования ростовой капилляр разламывался возле выросших кристаллов, кристаллы переносились в рентгеновский тонкостенный (толщина стенок 0.01 мм) капилляр, в котором его герметизировали вместе с каплей маточного раствора. При этом кристалл слегка подсушивали прикосновением полоски фильтровальной бумаги, с тем чтобы в процессе рентгенов-
Рис. 4. Фотография выращенных в капилляре кристаллов.
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКА ЛИЗОЦИМА
147
Рис. 5. Рентгенограмма кристалла лизоцима.
ского эксперимента не происходило растворения кристалла в остаточной капле растворителя.
Так как вывод о совершенстве полученных в опыте кристаллов можно было сделать только на основании статистического анализа большого набора интенсивностей рентгеновских рефлексов, были определены геометрические характеристики кристалла и собран дифракционный набор до разрешения 1.5 А. Работа велась на дифрактомет-ре, оснащенном позиционно-чувствительным детектором ЫАЯ345. Источником излучения служила рентгеновская трубка БСВ29 с медным анодом. В работе использовался монохроматор с кристаллом пиролитического графита. Набор интенсивностей собирался путем съемки рентгенограмм колебаний с интервалом углов колебания кристаллов 1°. Было снято 75 рентгенограмм, что позволило собрать набор с полнотой 97.8% в интервале углов дифракции, позволяющих получение разрешения до 1.5 А. Параметры кристаллической ячейки составили: а = 79.131, Ь = 79.131, с = 37.992 А, а = в = у = 90°, пространственная группа 75 (Р4); мозаичность кристалла 0.204, среднее отношение {I )/а = 3.5 при разрешении до
1.89 А, число рефлексов с I > 3а - 55%, число уникальных рефлексов - 4133, средний ^-фактор по эквивалентным отражениям - 5.63% в зоне разрешения до 1.6 А.
Полученные характеристики набора интенсивностей указывают на весьма высокое, с современных позиций, качество выращенного кристалла.
На рис. 5 представлена рентгенограмма одного из выращенных кристаллов, снятая с экрана управляющего компьютера дифрактометра.
ВЫВОДЫ
Разработан метод направленной кристаллизации биоматериалов в капиллярах с созданием локального температурного градиента в растворе, позволяющий автоматически управлять процессом кристаллизации по заданной программе и получать биокристаллы, пригодные для рентгено-структурного анализа. Возможность раздельно создавать оптимальные условия, сначала для образования зародышей, а затем для роста образовавшихся кристаллов, позволяет существенно
улучшать качество кристаллов, т.е. атомное разрешение их структуры.
Авторы выражают глубокую признательность Лаборатории белковой кристаллографии ИК РАН за любезно предоставленные материалы, а также и лично И.П. Курановой за замечания и плодотворные обсуждения.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Калужской области (грант № 04-02-97213).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Куранова И.П. // Поверхность. 2004. № 6. С. 4.
2. Chayen N.E. // Current Opinion in Structural Biology.
2004. V. 14. P. 577.
3. Безбах И.Ж., Захаров Б.Г., Стрелов В.И. и др. Сб. тр. VI Междунар. конф. "Рост монокристаллов и тепломассоперенос", Обнинск, 25-30 сентября
2005. Т. 3. С. 545.
4. Rosenberger F., Howard S.B, Sowers J.W., Nyce T.A. // J. Cryst. Growth. 1993. V. 129. P. 1.
5. Lin H., Rosenberger F., Alexander J.I.D., Nadara-jah A. // J. Cryst. Growth. 1995. V. 151. P. 153.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.