ПОВЕРХНОСТЬ. РЕНТГЕНОВСКИЕ, СННХРОТРОННЫЕ И НЕЙТРОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2004, < 6, с. 4-12
УДК 548.527;547.96
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ НА ЗЕМЛЕ И В НЕВЕСОМОСТИ
© 2004 г. И. П. Куранова
Институт кристаллографии им. А. В. Шубникова РАН, Москва, Россия Поступила в редакцию 29.08.2003 г.
Результаты структурных исследований макромолекул находят все большее применение в биотехнологии, медицине, фармакологии. В связи с возросшей потребностью в кристаллах макромолекул, пригодных для структурных исследований, кристаллизация белков выделилась в самостоятельное направление. Существенный вклад в улучшение качества кристаллов и изучение механизмов роста вносят эксперименты в условиях невесомости, когда в отсутствие конвекционных потоков массопе-ренос осуществляется посредством диффузии. Сравнение показывает, что более чем 20% кристаллов, выращенных в условиях микрогравитации, превосходят по качеству лучшие кристаллы, получаемые на Земле.
ВВЕДЕНИЕ
Кристаллизация белков, первоначально возникшая как один из способов их очистки, в настоящее время превратилась в важную самостоятельную область исследования, которая продолжает интенсивно развиваться. Стимулом этого развития являются потребности структурной биологии, поскольку кристаллы используются для установления пространственной структуры биомакромолекул методом рентгеноструктурного анализа.
Становление и развитие метода рентгеност-руктурного анализа применительно к исследованию макромолекул, связанное с именами нобелевских лауреатов М. Перутца и Дж. Кендрью, относится к выдающимся достижениям науки прошлого века. Благодаря рентгеноструктурным исследованиям были выяснены основные принципы структурной организации белков, нуклеиновых кислот и вирусов, что определило успех многих исследований в области молекулярной биологии.
В наступившей постгеномной эре потребность в эффективной кристаллографии макромолекул еще более увеличивается. Знание пространственных структур белков - продуктов генов человека, вирусов, а также биологически важных компонентов клетки остается необходимым в фундаментальном плане для понимания механизмов функционирования биологических систем и, кроме того, становится все более востребованным в биотехнологии, медицине, фармакологии.
В связи с развитием белковой инженерии результаты исследования пространственных структур макромолекул можно применить для совершенствования биотехнологических производств. Белки в качестве катализаторов используют во многих индустриальных процессах, например при производстве пива, моющих средств, в хлебопече-
нии. Основываясь на данных об атомном строении макромолекулы, методы белковой инженерии позволяют направленно изменять ее структуру и придавать ей новые требуемые свойства, например увеличить продолжительность функционирования или эффективность в условиях производства. Структурно направленный поиск лекарств основан на том, что именно белки являются мишенью для многих из них [1, 2]. Для проявления лечебного действия лекарство должно эффективно связаться с белком на основе химической и геометрической комплементарности подобно тому, как фермент связывается с субстратом. Моделирование на атомном уровне взаимодействия белков-рецепторов с низкомолекулярными агентами служит для создания лекарств нового поколения; изучение взаимодействий антиген-антитело открывает новые возможности для понимания механизмов формирования иммунитета. Сходным образом результаты структурных исследований используются в сельском хозяйстве для синтеза наиболее эффективных инсектицидов и гербицидов.
Между тем для того, чтобы сделать белок объектом рентгеноструктурного исследования, его необходимо не только закристаллизовать, но и получить достаточно крупный монокристалл с хорошо упорядоченной кристаллической решеткой, дающий четкую дифракционную картину до разрешения не менее 3 А. Отсюда понятен возрастающий интерес к выращиванию кристаллов белков и исследованию процессов кристаллизации. В настоящее время в практику белковой кристаллизации и изучение закономерностей этого процесса вовлечены биологическое, химическое и физическое научные сообщества. Возникла новая мультидисциплинарная наука о строении и росте кристаллов макромолекул, преимущест-
венно белков, которая получила название "био-кристаллогенезис" [3].
Несомненны успехи, достигнутые в получении белковых кристаллов. Достаточно упомянуть, что в банке белковых структур в настоящее время депонированы атомные координаты более чем 7000 макромолекул, структура которых установлена рентгенографически. Совершенствуется техника кристаллизации. Развиваются некоторые рациональные подходы, позволяющие предсказать условия кристаллизации, например прослеживается корреляция между способностью раствора белка к кристаллизации и значением второго переменного коэффициента на кривой светорассеяния [4, 5]. Методы белковой инженерии позволяют создавать новые межмолекулярные контакты в кристаллической решетке, чтобы получить кристаллы белков, ранее не закристаллизованных, или улучшить качество имеющихся кристаллов [6, 7]. Интенсивно изучаются механизмы кристаллизации [8].
И тем не менее даже сейчас, когда предложены многочисленные методики кристаллизации биомакромолекул и наблюдается значительный прогресс в понимании механизмов этого процесса, получение высококачественных кристаллов белков остается самой непредсказуемой стадией, от которой зависит успех всего исследования пространственной структуры.
Главной причиной, затрудняющей получение белковых кристаллов, являются уникальные свойства самой белковой молекулы. По этой причине и кристаллы, образованные такими молекулами, и сам процесс кристаллизации характеризуются рядом особенностей, что до сих пор не позволяет поставить производство кристаллов под достаточный контроль кристаллографов, и кристаллизация белков продолжает оставаться эмпирической наукой рациональных проб и ошибок, направляемых результатами предыдущих попыток.
ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ БЕЛКОВ И БЕЛКОВЫХ КРИСТАЛЛОВ
Молекула белка, построенная из уникальным образом уложенной полипептидной цепи, имеет высокий молекулярный вес (от 1.5 до 500 кДа) и характеризуется несколькими уровнями пространственной организации (вторичная, третичная и четвертичная структуры) [9]. Белковая глобула, поддерживаемая водородными связями и гидрофобными взаимодействиями, сохраняет свою структуру только в водном растворе, обычно в присутствии различных солей, в ограниченном интервале температур (от 4 до 40°С) и в ограниченном интервале значений рН среды. Белки денатурируют при повышении температуры, при высоких концентрациях органических растворителей и других реагентов, разрушающих водород-
ные или гидрофобные связи. Полипептидная цепь может расщепиться при бактериальном заражении. В то же время некоторые белки выдерживает быстрое замораживание и могут храниться длительное время при температуре жидкого азота.
Большинство белков в растворе склонны к агрегации, часто имеют несколько минимумов растворимости и способны образовывать не только кристаллический, но и аморфный осадок. На поверхности белковой глобулы расположено большое число полярных функциональных групп, как нейтральных, так и несущих положительный или отрицательный заряд, суммарная величина которого может изменяться в зависимости от рН раствора. В первом приближении белковую молекулу можно рассматривать как поливалентный ион со сложным нерегулярным рельефом поверхности, окруженный слоем из прочно связанных молекул воды. Молекула белка обладает значительной конформационной подвижностью, так что в одном и том же растворе она может существовать в нескольких находящихся в равновесии конфор-мационных формах. Совокупность перечисленных свойств и обусловливают особенности кристаллизации белков.
Сами кристаллы, построенные из белковых молекул, имеют большие параметры элементарной ячейки и по ряду свойств отличаются от кристаллов низкомолекулярных соединений. Поскольку белки построены из аминокислот одного энантиоморфного ряда, их кристаллы не обладают инверсионной симметрией и имеют простые формы. Кристаллы белков невелики, при этом размер порядка 0.5 мм в каждом направлении, как правило, оптимален для рентгенографического исследования. На источниках синхротронного излучения могут использоваться кристаллы размером до 0.1 мм. Кристаллы белков весьма хрупки, разрушаются при неосторожном прикосновении и за пределами ограниченного интервала температур и значений рН. Кристаллическая решетка поддерживается в основном за счет водородных и электростатических связей, при этом число связей между соседними молекулами на единицу поверхности намного меньше, чем в кристаллах малых молекул. Сложный рельеф поверхности и обилие функциональных групп, способных образовывать прочные связи с растворителем, приводят к тому, что белковый кристалл включает в свой состав от 30 до 90 % воды. Решетка белкового кристалла напоминает сеть, где пространство между молекулами занято каналами, заполненными растворителем. Высокое содержание воды и слабые связи между молекулами объясняют хрупкость белковых кристаллов, являются одной из причин полиморфизма и разупорядоченности. С другой стороны, именно благодаря водному окружению структура белка в кристалле не отличается от структуры в растворе.
Благодаря слабым межмолекулярным контактам и разнообразию конформаций белковый кристалл имеет блочное строение. Поскольку отдельные блоки разориентированы друг относительно друга, белковый кристалл характеризуется определенной величиной мозаичности, которая отражает степень разупорядоченности блоков.
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ
Общий принцип получения кристаллов из белковых растворов - постепенное понижение растворимости белка до достижения пересыщения путем добавления солей, смешивающихся с водой органических растворителей или органических полимеров - полиэтиленгликолей и их эфиров разного молекулярного веса [10].
Как и в случае низкомолекулярных соединений, при достижении пересыщения система, содержащая белок, движется к состоянию равновесия, при котором вещество распределяется между раствором и твер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.