Кристаллы для изучения белковых структур
И.П.Куранова, М.В.Ковальчук
Огромные успехи в изучении механизмов работы биологических макромолекул и их ансамблей в значительной степени основаны на результатах рентгеноструктурно-го анализа (РСА) этих молекул. Этот метод дает возможность определить атомные координаты составляющих кристалл атомов и воссоздать атомную структуру молекулы посредством математических расчетов по дифракционной картине, получаемой при рассеянии рентгеновских лучей белковым кристаллом. Хотя в настоящее время для исследования пространственных структур применяются и другие методы (например, ядерного магнитного резонанса), ведущая роль рентгено-структурного анализа сохраняется — более 80% пространственных структур, представленных в Международном банке белковых данных, установлены именно этим методом [1, 2]. В этом банке сегодня уже хранятся координаты десятков тысяч различных глобулярных белков, но для белковой инженерии, биотехнологии, медицины, фармакологии требуются данные о все новых и новых структурах.
В Институте кристаллографии изучение пространственных структур белковых молекул начал Б.К.Вайнштейн* еще
* Подобнее см.: Вайнштейн Б. К Кристаллография сегодня // Природа. 1974. №3. С.44—53.
© Куранова И.П., Ковальчук М.В.,
2014
Инна Петровна Куранова, доктор химических наук, главный научный сотрудник отдела рентгеновских методов анализа и синхротронного излучения Института кристаллографии РАН (ИК РАН). Основные научные интересы связаны с кристаллизацией белков и исследованием их структуры и функции методом рентгеноструктурного анализа.
Михаил Валентинович Ковальчук, член-корреспондент РАН, директор НИЦКИ, руководитель межведомственной рабочей группы по направлению «Приоритетные и междисциплинарные научные исследования» Совета при Президенте РФ по науке и образованию, декан физического факультета Санкт-Петербургского университета. Лауреат премий правительства РФ в области науки и техники, в области образования, премии им.Е.С.Федорова РАН. Кавалер орденов «За заслуги перед отечеством» III и IV степеней. Область научных интересов — кристаллография и кристаллохимия, физика конденсированного состояния, нанобиоорганиче-ские материалы и системы, применение рентгеновского, синхротронного излучения и нейтронов в материаловедении.
в 1959 г. В созданной им лаборатории выращиванием пригодных для структурного исследования белковых монокристаллов и расшифровкой пространственных структур занималась группа сотрудников, в состав которой входили биологи, физики и химики. Работы по определению и анализу пространственных структур гемовых белков (леггемоглобина и каталазы), неорганических пирофосфа-таз, участвующих в биосинтезе и трансформации энергии в живых организмах, L-аспарагиназы, используемой при лечении ряда видов опухолей, вируса крапчатости гвоздики, а также саикарсинтазы, во-
влеченной в биосинтез пуринов, получили международное признание [3].
Сегодня технические возможности для структурных исследований существенно расширились: снижены требования к размеру белковых кристаллов, а для получения более совершенных успешно применяются новые методы их выращивания; усовершенствовано получение дифракционных наборов; современная вычислительная техника ускорила обработку дифракционных данных. Значительный прогресс в белковой кристаллографии достигнут благодаря созданию новых мощных источников рентгеновского излучения — синхротронов. В нашей стране такие исследования успешно ведутся на Курчатовском источнике синхротронного излучения (СИ) [4, 5]. К настоящему времени сотрудники Института кристаллографии установили строение и механизмы функционирования многих белков, внесли в международную базу данных атомные координаты более чем 150 белков и их комплексов с функционально важными молекулами.
Изучаются структуры и механизмы действия ряда белков, важных для медицины и биотехнологии, таких как тимидинфосфорилаза, фосфопантете-ин-аденилилтрансфераза из туберкулезной бактерии, бактериальная карбоксипептидаза [6—8] и др. В лаборатории рентгеновских методов анализа и синхротронного излучения ИК РАН успешно продолжаются эксперименты по выращиванию кристаллов белков в невесомости.
Как получают кристаллы белков
Рентгеноструктурный анализ и в настоящее время остается методом, дающим наиболее полную информацию о пространственной структуре белков и нуклеиновых кислот*.
Рентгеноструктурное исследование протекает в несколько этапов. Начинается оно с получения кристаллов выбранного для исследования вещества. На последующих этапах от белковых кристаллов на источниках рентгеновского излучения собирают дифракционные наборы, которые с помощью математического аппарата и специальных программ позволяют расшифровать строение изучаемой молекулы, т.е. установить пространственные координаты всех атомов (кроме водородных, положение которых определяют при разрешении менее 1 А).
Биохимики давно обратили внимание на способность белков образовывать кристаллы и использовали кристаллизацию как одну из стадий очистки белков. Еще в 1840 г. немецкий исследователь Ф.Л.Хунефельд наблюдал под микроско-
* О методе РСА для исследования пространственных структур белков подробнее см.: Владимиров Ю. А Зачем нужна белковая кристаллография // Природа. 2003. №11. С.26—40.
Пространственная структура молекулы неорганической пи-рофосфатазы Пвгтиз МегторМ1и$.
пом формирование кристаллов гемоглобина червя; американский химик Дж.Б.Самнер в 1926 г. получил кристаллы фермента уреазы. За выделение и кристаллизацию ферментов он вместе с Дж.Х.Нортропом в 1946 г. был отмечен Нобелевской премией.
Однако для структурного исследования белковые кристаллы должны удовлетворять ряду требований [9]. Так, дифракционная картина от монокристаллов должна давать разрешение не ниже 2.5 А. Для выращивания кристаллов с нужными свойствами разработаны специальные методики. Все они сводятся к смешиванию малых объемов растворов белка и осадителя (вещества, понижающего растворимость белка), но отличаются способом смешивания. В качестве осадителей обычно используют неорганические соли, амфифильные органические растворители, растворимые в воде органические полимеры, например, полиэтилен-гликоли. Самый распространенный метод кристаллизации — диффузия паров растворителя в капле. Тогда на дне замкнутого сосуда находится раствор осадителя, а капля концентрированного раствора белка — например на «пьедестале». Другой метод — свободная диффузия через поверхность раздела между растворами белка и осадителя. В этом случае осадитель аккуратно наносят на поверхность белкового раствора, помещенного в капилляр или пробирку малого диаметра, после чего оба раствора смешиваются посредством диффузии. Очень проста кристаллизация под слоем парафинового масла, когда несколько микролитров раствора с равными объемами белка и осадителя заливают слоем парафинового масла. Медленное испарение раствора уменьшает скорость кристаллизации и способствует увеличению размера кристалла.
Сложности кристаллизации
Несмотря на усовершенствование техники рентгеновского анализа и методов кристаллизации, получение качественных белковых кристаллов продолжает оставаться наименее предсказуемым этапом, от которого зависит не только успех структурного исследования, но и время, затраченное на его проведение.
Одна из причин возникновения трудностей при поиске условий кристаллизации — отсутствие критериев для рационального выбора осади-теля, способствующего формированию кристалла. Чтобы ускорить постановку проб для поиска условий, сегодня используют специальные роботы, которые позволяют поставить тысячи кристаллизационных проб в ограниченное время.
Другие затруднения вызваны тем, что, в отличие от кристаллов низкомолекулярных соединений, белковые кристаллы начинают формироваться только в сильно пересыщенном растворе. В этом случае одновременно происходят и образование зародышей кристаллов (нуклеация), и их рост. Из-за большого количества зародышей и высокой скорости роста появляется много мелких кристаллов. Для получения кристаллов большего размера и лучшего качества необходимо выращивать их в минимально пересыщенном растворе, в метастабильной зоне. Часто для разделения стадий нуклеации и роста используют так называе-
Фазовая диаграмма, показывающая растворимость белка как функцию концентрации осадителя. Приведены кривая растворимости (1) и кривая критического пересыщения (2), над которой белок выпадает в виде аморфного или мелкокристаллического осадка. В зоне нуклеации одновременно происходит образование кристаллических зародышей и рост мелких кристаллов. Оптимальные условия для роста крупных кристаллов — в метастабильной зоне (показано стрелками).
мые затравки: вносят в слабо пересыщенный белковый раствор ограниченное число зародышей или несколько микрокристаллов.
Однако главные причины, затрудняющие получение кристаллов растворимых глобулярных белков, кроются в свойствах самой белковой молекулы. Построенная из уникально уложенной полипептидной цепи, эта молекула с высокой молекулярной массой (от 1.5 до 500 КДа) имеет несколько уровней пространственной структуры — первичную, вторичную, третичную и четвертичную. Белковая глобула, поддерживаемая водородными связями и гидрофобными взаимодействиями, сохраняет свою структуру только в водном растворе (обычно в присутствии различных солей) и лишь в ограниченном интервале температур и значений рН. Очень часто молекула белка состоит из нескольких глобул (четвертичная структура), когда для повышения стабильности глобулы возникает необходимость спрятать оказавшиеся на поверхности гидрофобные аминокислотные остатки. Объем белковой глобулы с длиной цепи 220—250 аминокислотных остатков может достигать 1500 А3, а площадь ее поверхности около 8000—10 000 А2.
Полипептидная цепь белка распадается при бактериальном заражении. Белки денатурируют при высоких концентрациях органических растворителей и других реагентов, разрушающих водородные связи и гидрофобные взаимодействия.
Кроме того, белки склонны к агрегации, имеют несколько минимумов растворимости и наряду с кристаллами образую
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.