ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 171-176
УДК 577.151.6
КСИЛАНАЗА И ЦЕЛЛЮЛАЗА ГРИБА Cerrena unicolor ВКМ F-3196: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
© 2014 г. О. В. Белова*, А. В. Лисов*, Н. Г. Винокурова*, А. А. Костеневич**, Л. И. Сапунова**, А. Г. Лобанок**, А. А. Леонтьевский*, ***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290 **Институт микробиологии НАНБеларуси, Минск, 220141, Беларусь ***Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, 142290
e-mail: ssl206@rambler.ru Поступила в редакцию 16.09.2013 г.
Базидиомицет Cerrena unicolor ВКМ F-3196 в условиях глубинного культивирования в среде, содержащей микрокристаллическую целлюлозу, способен продуцировать ксиланазу и целлюлазу. Методом ионообменной и гидрофобной хроматографии получены препараты целлюлазы и ксиланазы в электрофоретически гомогенном состоянии. Молекулярная масса как целлюлазы, так и ксиланазы была ~44 кДа. Показано, что ксиланаза катализировала гидролиз ксилана с образованием ксилозы, ксилобиозы и ксилотетраозы и проявляла свойства эндоксиланазы. Целлюлаза гидролизовала карбоксиметилцеллюлозу, ксилан, микрокристаллическую целлюлозу с образованием целлотриозы и целлотетраозы. Оптимум рН для действия обоих ферментов ~4.0. Ферменты обладали умеренной термостабильностью: ксиланаза сохраняла 35% от исходной активности в течение 1 ч при 60°C, целлюлаза — 10% при тех же условиях. Ксиланаза, целлюлаза, а так же их смесь осахаривали растительное сырье: пшеницу, рожь, пшеничные отруби, овес, что указывает на возможное применение этих ферментов в биотехнологии.
DOI: 10.7868/S0555109914020056
Основным возобновляемым источником энергии и сырья на Земле является растительная биомасса. Большую ее часть составляют полимеры клеточной стенки растений: целлюлоза, геми-целлюлоза, а также полиароматическое соединение — лигнин [1]. Молекула целлюлозы представляет собой линейный полимер, состоящий из остатков Р-Э-глюкозы, в состав гемицеллюлозы входят различные мономеры. Наиболее распространенным является Р-Э-ксилоза, формирующая основной компонент гемицеллюлоз — кси-лан, с которым могут быть связаны другие моносахара — а-Ь-арабиноза, а-Э-манноза, а-Э-глюкуроновая кислота [2, 3]. Полисахариды клеточной стенки растений могут гидролизоваться под действием целлюлолитического комплекса ферментов различных микроорганизмов: аэробных и анаэробных бактерий, дрожжей, мицели-альных грибов [4, 5]. Эндоглюканаза (целлюлаза) (КФ 3.2.1.4) фермент, входящий в состав целлю-лолитического комплекса, катализирует гидролиз Р-1,4-гликозидных связей в молекуле целлюлозы с образованием олигосахаридов различной молекулярной массы. Эндоксиланаза (КФ 3.2.1.8), подобным образом, катализирует расщепление Р-1,4-гликозидных связей в молекулах ксилана с образованием олигосахаридов различной молекулярной массы [6]. Целлобиогидролаза
(КФ 3.2.1.91) катализирует отщепление целлоби-озы с нередуцирующего конца целлюлозной цепи. Окончательный гидролиз олигосахаридов, продуктов гидролиза целлюлозы и ксилана, до моносахаров происходит под воздействием двух ферментов — Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21) и Р-ксило-зидазы (КФ 3.2.1.37). Все эти ферменты присутствуют у дереворазрушающих грибов. Целлюлазы базидиомицетов практически не гидролизуют микрокристаллическую целлюлозу, в то время как целлобиогидролаза взаимодействует с этим субстратом [5].
Гидролазы, разрушающие полисахариды растений, находят широкое практическое применение. Целлюлазы используют в текстильной промышленности для смягчения растительных волокон, для осахаривания растительного сырья при получении биотоплива, в составе стиральных порошков, [7]. Ксиланазы применяют для отбеливания бумажной массы при производстве бумаги, для улучшения пекарских свойств муки [8—10]. Оба фермента также успешно используются для увеличения питательной ценности кормов для сельскохозяйственных животных — обработки зерновых злаков, соломы, отрубей. Целлюлоза и ксилан не перевариваются пищеварительной системой животных с однокамерным желудком (свиньи, птица, кролики), обработка кормов гид-
ролитическими ферментами повышает содержания олиго и моносахаридов, и, следовательно, увеличивает перевариваемость корма [11].
Согласно данным Росстата (http://www.gks.ru/) за последние 10 лет в России производство мяса в целом выросло в 1.7 раз, а производство, например, мяса птицы выросло в 3.79 раз. При этом с каждым годом наблюдается рост производства, что обусловливает возрастающую потребность в ферментных препаратах для обработки кормов. Для промышленного производства препаратов гидролитических ферментов используют штаммы-продуценты грибного и бактериального происхождения. Учитывая возрастающие потребности в дешевых ферментах, в мире ведется постоянная работа по поиску новых продуцентов, в том числе среди дереворазрушающих аскомицетов [12, 13]. Возможность использования базидиоми-цетов как продуцентов ферментных препаратов гидролаз изучена в значительно меньшей степени, хотя их дереворазрушающий потенциал не уступает потенциалу аскомицетов [14].
Цель работы — получение препаратов ксилана-зы и целлюлазы базидиомицета Cerrena unicolor, изучение их физико-химических свойств, а также оценка возможности их использования для осаха-ривания растительного сырья.
МЕТОДИКА
Культивирование гриба. В работе был использован штамм гриба Cerrena unicolor В КМ F-3196 (Bull.) Murrill, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (http:// www.vkm.ru/). Культуру гриба хранили в пробирках на скошенном сусло-агаре при температуре 4°C.
Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 200 мл среды, на качалке (200 об/мин) при 30°C в течение 5 сут. Среда для культивирования имела следующий состав (г/л): KH2PO4 - 0.3; MgSO4 • 7H2O - 0.2; дрожжевой экстракт — 3, пептон — 0.5, глюкоза — 10.0 или микрокристаллическая целлюлоза — 10.0 (для получения внеклеточных ферментов); рН среды 5.0.
В качестве посевного материала использовали суспензию 5-суточного мицелия, полученного в описанных выше условиях и механически измельченного с использованием фарфоровых бус, в количестве 0.5 об. %.
Очистки ксиланазы и целлюлазы. По окончании культивирования мицелий гриба отделяли от культуральной жидкости на фильтре Шотта (размер пор 100—120 мкм). Затем фильтрат культу-ральной жидкости концентрировали с помощью фильтрования через полые волокна на аппарате АР-0.2-5ПА ("Биотест", Россия), предел исключения мембраны 5 кДа. После подведения рН до 8.2, концентрат наносили на колонку (25 х 3 см) с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенную 20 мМ трис-HCl буфером, рН 8.2. Элюцию белков проводили
линейным градиентом (0—0.5 М NaCl, 300 мл), со скоростью — 2.5 мл/мин.
Фракции с активностью гидролаз объединяли, насыщали (NH4)2SO4 до концентрации 1.0 М, наносили на колонку (30 х 2 см) с гидрофобным носителем фенил-сефарозой ("GE Healthcare", США), уравновешенную 1.0 М (NH4)2SO4 в 20 мМ трис-HCl буфере, рН 8.2. Элюцию проводили линейным градиентом (NH4)2SO4 (1.0—0 М, 60 мл), скорость элюции — 2 мл/мин. Далее для очистки ферментных белков использовали систему AKTAFPLC ("GE Healthcare", США) с ионообменной колонкой UNO Q6 ("Bio-Rad", США). Собранные активные фракции, полученные после гидрофобной хроматографии, диализовали против 5 мМ трис-HCl буфера, рН 8.2, для удаления соли и наносили на колонку UNO Q6. Элю-цию проводили линейным градиентом 0—0.5 М NaCl (объем 180 мл) со скоростью 1 мл/мин. Активные фракции объединяли и диализорвали против 20 мМ ацетатного буфера, рН 4.5 (предел исключения мембраны 10 кДа). Затем ферментный препарат концентрировали с помощью микроконцентраторов Vivaspin 2 ("Sartorius", Германия). Концентрированный препарат использовали для дальнейшей работы.
Электрофорез. Гомогенность и молекулярную массу полученных белков определяли методом электрофореза в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях согласно Лэммли. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор Unstained protein MW marker ("Fermentas", Литва).
Характеристика ферментов. Активность цел-люлазы и ксиланазы определяли по скорости образования восстанавливающих сахаров в результате гидролиза КМ-целлюлозы и ксилана бука ("Sigma", США). Реакцию проводили в 20 мМ ацетатном буфере, рН 5.0, при температуре 40°C и концентрации субстрата в реакционной смеси 0.8%. Количество восстанавливающих сахаров определяли феррицианидным методом [15] с использованием калибровочных графиков, построенных по глюкозе в случае целлюлазы или ксилозе (для ксиланазы). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование одного микромоля восстанавливающих сахаров за 1 мин в условиях проведения реакции (40°C, рН 5.0).
Определение рН-оптимума действия ферментов проводили в диапазоне рН 3.0—10.0 с использованием 50 мМ универсального буфера [16]. Термостабильность гидролаз исследовали при температурах 50, 60, 70°C в том же буфере, рН 5.0, в течение 1 ч. О степени инактивации ферментов судили по их остаточной активности, которую выражали в % к исходной. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд.
Исследование продуктов реакции. Гидролиз ксилана бука и микрокристаллической целлюлозы (Avicell РН 101, "Sigma", США) в присутствии фермента проводили при оптимальном значении
рН 4.0 и концентрации субстрата 1.0% (масса/объем). Объем реакционной смеси — 1.0 мл, количество фермента — 5 ед./мл. Реакцию проводили при 40°C, пробы для определения сахаров отбирали через 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 и 24 ч, выдерживали в кипящей водяной бане в течение 2 мин для остановки реакции.
Разделение продуктов реакции проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках HPTLC Silica gel 60 ("Merck", Германия). Элюирующая система — бутанол : уксусная кислота : вода в соотношении 2 : 1 : 1. После проведения хроматографии пластинку высушивали при температуре 105°C и опрыскивали проявителем. Для приготовления проявителя 50 мг дифениламина и 50 мкл анилина растворяли в 5 мл ацетона, перед опрыскиванием добавляли 0.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.