ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 12, с. 1304-1308
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.25:547.466
КУЛОНОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ АМИНОКИСЛОТ С ПРИМЕНЕНИЕМ ГАЛОГЕНОВ КАК ТИТРАНТОВ-ОКИСЛИТЕЛЕЙ
© 2007 г. Г. К. Зиятдинова, Л. В. Григорьева, Г. К. Будников
Казанский государственный университет, химический институт им. А.М. Бутлерова
420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 Поступила в редакцию 07.06.2006 г.
Установлено, что цистеин и метионин количественно взаимодействуют с электрогенерированными галогенами в условиях гальваностатической кулонометрии. Цистеин реагирует со всеми титрантами, метионин только с хлором и бромом. Стехиометрические коэффициенты реакций цистеина с галогенами составили 1 : 3, 1 : 3 и 1 : 1 для хлора, брома и иода соответственно, для метионина 1 : 2 для хлора и 1 : 1 для брома. Показано, что кулонометрическое титрование электрогенерированным иодом позволяет селективно определять цистеин в смесях с метионином. Установлено, что двукратные количества метионина не мешают определению цистеина. Разработана методика прямого кулонометриче-ского определения метионина в таблетках, относительное стандартное отклонение 0.03-0.05.
Серосодержащие органические соединения известны как один из важнейших классов антиокси-дантов (АО) в биологических системах. В организме человека серосодержащие аминокислоты участвуют в обмене веществ, выполняют функцию АО, защищая SH-группы белков цитоплазмы от окисления.
Серосодержащие аминокислоты имеют высокую константу скорости реакции с активными формами кислорода. Защитный эффект таких антиоксидантов основан на том, что в результате их окисления активными формами кислорода образуются промежуточные радикалы и молекулы, которые химически гораздо менее активны, чем исходные радикалы [1].
В связи с этим серосодержащие аминокислоты являются важными объектами исследования в науках о жизни, и разработка методов их определения представляет актуальную задачу.
Для определения серосодержащих органических соединений активно используют электрохимические методы. Так, восстановленные тиолы можно определять на модифицированных тирози-назой углеродных пастовых электродах. Иммобилизованная внутри электрода тирозиназа переводит катехин в о-хиноны, которые восстанавливаются на поверхности электрода до пирокатехина при потенциале -0.050 В (отн. нас. хлоридсереб-ряного электрода). Детектирование восстановленных тиолов основано на эффекте уменьшения скорости электронного обмена между тирозина-зой и медиатором (пирокатехином). Принципы работы этого устройства подобны наблюдаемым для некоторых биосенсоров на основе конкуренции за субстрат. Поскольку сигнал тока регистри-
руется при низких потенциалах, мешающее влияние со стороны других способных к окислению соединений типа аскорбиновой кислоты минимально. Благодаря так называемой амплификационной природе работы медиатора повышается чувствительность определения. В стационарных условиях при определении глутатиона градуировочный график линеен в интервалах 1-8 и 5-30 мкМ при концентрациях пирокатехина, служащего субстратом, 10 и 20 мкМ соответственно. Описанная система пригодна для анализа плазмы и цельной крови [2].
На основании того, что обычные хиноновые индикаторы усиливают отклик электрода по отношению к тиольным соединениям, может быть создан простой сенсор для определения восстановленных тиолов в физиологических жидкостях [3]. Изучено влияние структуры хинонов на протекание побочных реакций, характерных для ко-ньюгатов цистеина.
Описано электрохимическое поведение серосодержащих аминокислот на графитовых электродах, модифицированных пленкой гексациано-феррата(П) рутения(Ш). На модифицированном электроде в результате электрокаталитического окисления аминокислот снижается потенциал и увеличивается ток окисления по сравнению с немоди-фицированным электродом. Установлены электрохимические и гидродинамические условия регистрации максимального каталитического тока. Предложена методика определения цистеина, ци-стина и метионина в условиях проточно-инжекци-онного анализа [4].
Описан способ модифицирования углеродного пастового электрода ферроценом для определе-
ния L-цистеина методами дифференциальной импульсной вольтамперометрии и хроноамперомет-рии. Установлено, что при рН 7.0 цистеин окисляется на поверхности такого электрода при 0.5 В. Градуировочный график линеен в диапазоне 1 х х 10-3-1 х 10-5 М цистеина [5].
Оптические методы анализа также применяют при определении серосодержащих АО в различных объектах.
Описан проточно-инжекционный метод для индивидуального определения L-цистеина и L-ци-стина и их смеси, основанный на реакции L-цистеина с трмс(2,2'-бипиридил)рутений(Ш) и перокси-дисульфатом при УФ-облучении для получения хемилюминесценции. Цистин определяют после восстановления до цистеина в кадмиевом редукторе в миниколонке в системе проточно-инжекцион-ного анализа. Конфигурация системы позволяет определять два серосодержащих компонента одновременно. Градуировочные графики линейны в диапазоне концентраций 2 х 10-6-5 х 10-4 М для цистеина и 1 х 10-6-2 х 10-4 М для цистина [6].
Разработан простой, чувствительный и селективный метод хемилюминесцентного определения цистеина в сыворотке крови человека, основанный на том, что слабая хемилюминесценция цистеина, окисляемого Ce(IV), значительно усиливается в присутствии хинина [7]. Градуировочный график линеен в интервале концентраций 3.5 х 10-9-3.5 х 10-6 М, предел обнаружения 2.5 х х 10-9 М (s/N = 3).
Описан метод флуоресцентного определения цистеина, основанный на значительном увеличении интенсивности флуоресценции при взаимодействии с альдегидом [8].
В сложных биологических системах определение индивидуальных АО осложнено влиянием компонентов матрицы, поэтому используют хроматографию, чаще всего высокоэффективную жидкостную, с различным детектированием: электрохимическим по потенциалу окисления или оптическим по поглощению света и др.
Разработана методика определения общего содержания цистеина в плазме крови человека, основанная на получении его производных по тиольной группе с иодидом 2-хлор-1-метилпири-диния, осаждении белков хлорной кислотой с последующим анализом надосадочной жидкости методом ВЭЖХ с обратимыми фазами на колонке LICHRO CART C8 в потоке смеси 0.01 М буферного раствора из CCl3COOH (рН 2.2) - CH3CN с детектированием при 312 нм. Градуировочный график линеен в интервале 20-300 нг/мл. Предел обнаружения ^-критерий) 0.5 нмоль/мл. Нижняя граница определяемых концентраций (^-критерий) - 1.5 нМ [9].
Описано применение амперометрического детектирования с угольным электродом, располо-
женным в конце колонки для капиллярной жидкостной хроматографии для определения тиолов в пробах мочи. Этот амперометрический детектор обладает хорошими показателями стабильности и селективности при определении тиолсодержащих соединений. Найдены условия эффективного разделения и определения цистеина, глутатиона, до-памина и 6-тиопурина с пределами обнаружения 2 х 10-7, 5 х 10-7, 2 х 10-7 и 5 х 10-7 M соответственно [10].
Удовлетворительные результаты получены при определении глутатиона, цистеина и цистеин-содержащих пептидов в тканевых гомогенатах печени крыс [11], основанном на взаимодействии определяемых компонентов с ^(2,4-динитрофе-ниламиноэтил)малеинимидом при 40°C и рН 5.8 в течение 10 мин с последующим детектированием при 350 нм. В этих условиях прямопропорциональ-ная зависимость площади пика от концентрации глутатиона и цистеина наблюдается в диапазоне от 10 пмоль до 2 нмоль. Возможно определение у-глу-тамидцистеина, цистеинилглицина и гомоцистеи-на с пределом обнаружения 5 пмоль.
Известна методика хроматографического определения энантиомеров селеноаминокислот (селено-метионина, селеноцистина), содержащихся в бразильских орехах Bertholletia excella, основанная на использовании колонки с хиральной краун-эфир-ной неподвижной фазой, HC1O4 в качестве элюен-та и масс-спектрометрического детектирования с индуктивно связанной плазмой или электрораспылительной ионизацией [12].
Имеется опыт успешного использования гальваностатической кулонометрии с электрогенери-рованными титрантами для определения серосодержащих соединений [13].
Из вышесказанного следует, что разработка методов контроля содержания серосодержащих аминокислот и динамика их превращения в различных объектах актуальна.
Целью настоящей работы является получение информации о протекании реакций цистеина и метионина с электрогенерированными галогенами и разработка на ее основе методик прямого количественного определения серосодержащих аминокислот.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Электрогенерацию галогенов осуществляли на потенциостате П-5827 M при постоянной силе тока 5.0 мА из водных 0.2 M растворов KC1 и KBr в 0.1 M H2SO4 и из 0.1 M раствора KI в тартратном буферном растворе (рН 3.56). Конец титрования определяли амперометрической индикацией с двумя поляризованными платиновыми электродами (ДЕ = 300 мВ). Рабочим электродом служила гладкая платиновая пластинка площадью 1 см2, вспо-
1306 ЗИЯТДИНОВА и др.
Таблица 1. Стехиометрические коэффициенты реакций цистеина и метионина с электрогенерированными галогенами
Соединение Структурная формула Соотношение
v(в-ва) : v(Cl2) v(в-ва) : v(Br2) v(в-ва) : v(I2)
Цистеин Метионин Н8-СН2-СН(Ш2)-СООН Н3С-8-(СН2)2-СН(Ш2)-СООН 1 : 3 1 : 2 1 : 3 1 : 1 1 : 1
могательным электродом - платиновая спираль, отделенная полупроницаемой перегородкой от анодного пространства ячейки.
Кулонометрическое определение проводили следующим образом. В ячейку объемом 50.0 мл вводили 20.0 мл фонового раствора, опускали электроды, включали генераторную цепь и перемешивание. По достижении определенного значения индикаторного тока в ячейку вносили аликво-ту исследуемого раствора (0.1-2.0 мл) и одновременно включали секундомер. Конечную точку титрования фиксировали по достижению первоначального значения индикаторного тока. При этом выключали секундомер и отключали генераторную цепь.
Вольтамперометрические измерения проводили следующим образом. В электрохимическую ячейку объемом 50.0 мл вносили
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.