РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 2
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК НА ТРЕХМЕРНОЙ МАТРИЦЕ ИЗ РЕ-
КОМБИНАНТНОГО СПИДРОИНА 1
© 2009 г. О.Л. Пустовалова, М.М. Мойсенович, П.С. Еремин, А.Ю. Архипова, А.А. Рамонова, О.С. Соколова, В.Г. Богуш*, И.И. Агапов**, М.П. Кирпичников
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия;
*ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, Россия;
**ФНЦ трансплантологии и искусственньх органов им. В.И. Шумакова, Москва, Россия
Поступила: 11.03.2009. Принята: 12.05.2009
Рекомбинантный белок паутинной нити спидроин 1 использовали для создания трехмерной матрицы с пористой структурой для культивирования клеток. Материал изготовленной матрицы способствует адгезии и пролиферации клеток, и ее структура обеспечивает равномерность распределения клеток на поверхности и в глубине. Матрицы на основе ре-комбинантного спидроина 1 благодаря своим биофизическим характеристикам являются перспективным биоматериалом для трехмерного культивирования клеток.
Ключевые слова: спидроин, биоматериал, трехмерная клеточная культура
введение
Использование искусственных матриц для создания имплантатов на основе собственных клеток организма является перспективным направлением современной медицины. Матрица обеспечивает необходимые механические свойства, задает форму имплантата и является субстратом, обеспечивающим прикрепление, пролиферацию и пространственную ориентацию имплантируемых клеток [1, 2]. Матрицы в биореакторах для культивирования гибридом при производстве моно-клональных антител увеличивают плотность клеточной культуры, что приводит к повышению продуктивности и позволяет достичь желаемой концентрации производимых иммуноглобулинов [3].
В качестве материалов для создания матриц обычно используют керамические композиты, синтетические алифатические полиэфиры и биополимеры [4 — 6]. Критериями выбора материала являются его биологическая инертность, достаточная механическая прочность, способность к биодеградации в
Адрес: 119991, Москва, Воробьевы горы, д. 1, корп. 21, Биологический факультет МГУ. E-mail: ygum@yandex.ru
организме и нетоксичность продуктов распада. Использование синтетических полимеров в качестве матриц для трехмерных клеточных культур ограничено, так как при их деградации образуются кислые продукты распада, токсичные для клеток. Возможности использования биополимеров, таких как коллаген, эластин, протеогликан и фибро-нектин ограничены их невысокой механической прочностью [4].
Перспективными материалами для создания трехмерных матриц являются соединения на основе полимеров шелка шелкопряда и каркасной нити паутины [7]. Такие материалы позволяют создавать пористые матрицы с привлекательными механическими характеристиками, в том числе высокопрочные. Полученные матрицы характеризуются отличными адгезивными свойствами и не токсичны для человека [1, 8].
Использование материалов на основе нити паутины пока не нашло широкого распространения, в связи с невозможностью получения природного материала в достаточных количествах. Богуш В.Г. и сотрудники [9] разработали метод получения рекомбинант-ного аналога спидроина 1, белка каркасной нити паука Nephila clavipes с использовани-
ем генно-инженерных технологий. Возможность использования разработанного метода для получения материалов в промышленных масштабах наравне с высокими биофизическими характеристиками, делает биополимеры на основе рекомбинантного спидроина 1 перспективным для решения задач тканевой инженерии.
В настоящей работе мы изучили биосовместимость матриц на основе рекомбинантного аналога спидроина 1 in vitro для адгезии и пролиферации клеток. Использовали матрикс пористой структуры, которая в перспективе необходима для интеграции в окружающие ткани и васкуляризации им-плантата in vivo.
материалы и методы
Получение трехмерной матрицы изспидроина 1
Матрицу из очищенного лиофилизиро-ванного рекомбинантного спидроина 1 получали методом выщелачивания. Навеску 15 мг белка растворяли в 50 мкл 10%-ного раствора хлорида лития в 90%-ной муравьиной кислоте в течение 30 минут при 40 °С. Раствор центрифугировали 10 минут при 11300 g и 50 мкл супернатанта смешивали со 110 мг сухого хлорида натрия с размером кристаллов от 200 до 400 мкм. Далее формовали диск диаметром 10 мм и толщиной примерно 1 мм, высушивали при комнатной температуре, выдерживали в 96% этаноле в течение 120 мин, промывали дистиллированной водой 120 мин, дегазировали и стерилизовали в 96% этаноле.
Размер пор полученной матрицы в водной среде и структуру поверхности изучали с использованием лазерного сканирующего микроскопа Zeiss Axiovert 200M LSM510 META. Для исследования методом конфокальной микроскопии получали конъюгаты матрицы с флуорохромом TRITC. Исследовали изображение горизонтальной проекции серии оптических срезов слоя матрицы толщиной 45 мкм, выполненных с интервалом 0,9 мкм.
Отсутствие изолированных полостей полученной матрицы подтверждали с использованием стандартного теста на проницаемость. Образцы матрицы погружали в тушь на два часа, далее высушивали и исследовали срез, сделанный по средней линии образца.
Изучение адгезии клеток к матрице
Для подтверждения возможности адгезии клеток к поверхности матрицы из спидроина 1 суспензию культуры мышиных фибро-бластов 3Т3 с концентрацией 5000 клеток в 300 мкл инкубировали в течение 2 часов с образцом матрицы. Далее образцы отмывали от неприкрепившихся клеток и через 24 часа изучали на сканирующем электронном микроскопе Camscan S2 («Cambridge Instruments», Великобритания). Подготовку образцов для сканирующей электронной микроскопии проводили по стандартной методике, включающей фиксацию, дегидратацию и контрастирование напылением слоя золота на приборе Ion Coater IB-3 («Eico», Япония).
Прикрепившиеся клетки можно снять с внутренней и наружной поверхности матрицы инкубацией образцов в 0,53 мМ растворе ЭДТА, содержащем 0,05% трипсина в течении 20 минут при температуре 37 °С и постоянном встряхивании.
Определение динамики роста клеток в матрице
Для исследования динамики роста клеток образцы матрицы толщиной около 700 мкм после адгезии клеток 3Т3 на ее поверхности инкубировали в культуральной среде. Динамику роста клеток в трехмерной культуре сравнивали с ростом фибробластов на плоской поверхности. Через 1, 4 и 14 суток культивирования образцы изучали методом конфокальной микроскопии с использованием микроскопов Zeiss Axiovert 200M и Leica TCS SP5. Ядра клеток выявляли флуорохромами DAPI или SY-TOX Green. Для изучения динамики роста клеток проводили подсчет ядер на изображении горизонтальной проекции серии оптических срезов, выполненных с интервалом 0,65 мкм от поверхности до 600 мкм в глубину. Количество клеток на изображении соответствовало количеству клеток в известном объеме изученных образцов матрицы, что позволило определить среднее количество в пересчете на 1 мм3 матрицы. Анализ конфокальных изображений и подсчет количества клеток на мм3 матрицы проводили, используя программное обеспечение 3D for LSM Version 1.4.2.
Изучение распределения клеток в матрице
Производили подсчет клеток на изображениях горизонтальной проекции серии оптических срезов, выполненных с интервалом
Рис. 1. Пористая структура матрицы с диаметром пор 200 — 400 мкм. Горизонтальная проекция серии оптических срезов слоя матрицы толщиной 45 мкм, выполненных с интервалом 0,9 мкм (а). Поры связаны между собой каналами и отверстиями стенки. Оптический срез на уровне 250 мкм от поверхности матрикса (б)
0,65 мкм, соответствующих наружному, среднему и глубокому слоям матрицы, толщиной по 150 мкм. Определяли количество клеток в слоях относительно общего количества клеток в 450 мкм изученной толщины матрицы.
результаты
Получение трехмерной матрицы изспидроина 1
Для создания пористой структуры трехмерной матрицы использовали кристаллы NaCl известного диаметра. Кристаллы соли создают полости соответствующего размера и выбор диаметра используемых частиц, определяет диаметр пор будущей матрицы. В работе использовали кристаллы NaCl диаметром 200 — 400 мкм, что предполагает получение матрицы с таким же диаметром пор. Образцы полученной матрицы, находящейся в водной среде, изучали методом лазерной сканирующей микроскопии. На изображении горизонтальной проекции серии оптических срезов образца матрицы измеряли диаметр пор матрицы. Крупные поры сохраняют диаметр 200 — 400 мкм, соответствующий использованным при создании матрицы кристаллам №С1 (рис. 1а).
Помимо размера пор, важнейшим параметром, характеризующим структуру матрицы, является соединенность пор, которая обеспе-
чивает условия для миграции клеток внутрь матрицы, однородность условий культивирования клеток и механических свойств матрицы. Соединенность пор полученной матрицы была изучена стандартным методом определения степени проницаемости материала для частичек туши. Частички туши, в которую погружали образцы матрицы, равномерно прокрасили всю толщину образцов. Отсутствие неокрашенных участков свидетельствует о том, что в процессе получения матрицы не произошло образования замкнутых полостей. На изображениях, полученных при микроскопическом исследовании образцов, можно проследить, что поры связаны между собой каналами и отверстиями (рис. 1). Кроме того, материал, формирующий стенки пор, не плотный и образует полости и перфорации меньшего диаметра — от 5 до 15 мкм (рис. 2).
Изучение адгезии клеток к матрице
Способность клеток к адгезии на поверхности матрицы является одним из показателей биосовместимости материала, из которого изготовлена матрица. Для исследования адгезии на матрице из спидроина 1 в условиях in vitro использовали линию клеток мышиных фи-бробластов 3Т3. Суспензию клеток инкубировали с образцами матрицы и изучали методом сканирующей электронной микроскопии. Клетки прикреплялись к поверхности в течение 2 часов инкубации. Морфологию прикре-
известной толщины через 1, 4 и 14 суток после прикрепления (рис. 4). Через 1 сутки были
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.