ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 229-235
УДК 577.152,577.113,579.252
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НОВОГО МУТАНТА Trichoderma longibrachiatum TW 1-59-27 - ПРОДУЦЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗ И КСИЛАНАЗ, ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО СВОЙСТВ
© 2015 г. А. О. Беккаревич*, В. А. Немашкалов*, А. В. Кошелев*, Д. А. Горячев*, Т. В. Бубнова*, В. Ю. Матыс*, Д. О. Осипов**, Е. Г. Кондратьева**, О. Н. Окунев*, А. П. Синицын**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail:alexandra@ibpm.pushchino.ru **Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: inbi@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
В результате у-мутагенеза Trichoderma longibrachiatum TW1 и последующей селекции улучшенных продуцентов получен новый мутантный штамм TW1-59-27, способный эффективно секретировать целлюлазы и ксиланазы. При fed-batch культивировании нового мутанта TW1-59-27 активность ферментов значительно возрастала по сравнению с исходным штаммом TW1. Так, активность целлюлазы (по отношению к карбоксиметилцеллюлозе) и ксиланазы в культуральной жидкости му-тантного штамма увеличивалась в 1.8 и 2 раза соответственно, а содержание белка — в 1.47 раз. Активность этих ферментов в сухом ферментном препарате, полученном из КЖ мутанта TW1-59-27, возрастала в 1.3—1.8 раз по сравнению с препаратом из исходного штамма TW1. Условлено что цел-люлаза ферментного препарата из мутантного штамма проявляла максимальную активность при 55—65°С, а ксиланаза при 60°С. Оптимум рН для действия этих ферментов — 4.5—5.0 и 5.0—6.0 соответственно. Показано что содержание эндоглюканаз в ферментном препарате увеличивалось с 7 до 13.5% в значительной степени вследствие секреции эндоглюканазы 1. Ферментный препарат с повышенным содержанием эндоглюканазы 1 может быть перспективным для применения в качестве кормовой добавки в сельском хозяйстве.
Ключевые слова: целлюлазы, ксиланазы, эндоглюканаза 1, мутагенез, Trichoderma, fed-batch культивирование.
DOI: 10.7868/S0555109915020038
Целлюлоза является самым распространенным возобновляемым источником углерода. В растениях она обычно присутствует вместе с ге-мицеллюлозой, лигнином и пектином [1, 2]. В результате биоконверсии целлюлозы и гемицеллю-лозы могут быть получены различные сахара, спирты, органические кислоты и аминокислоты, полимеры, кормовые и пищевые продукты, а также энергия [1—3]. Карбогидразы (целлюлазы и ксиланазы) осуществляют биоконверсию целлюлозы и гемицеллюлозы в гексозы (преимущественно глюкозу), пентозы (преимущественно ксилозу) и другие сахара, которые затем могут быть превращены в различные продукты микробиологического синтеза [2, 3].
Одним из наиболее широко используемых в лабораторной и промышленной практике продуцентов целлюлаз и ксиланаз является Trichoderma ¡ощ^гасЫаШт — микроскопический гриб-сапрофит, характеризующийся высокой секреторной способностью [3, 4]. Целлюлазный ферментный комплекс из Т. ¡ощ^гасЫаШт представлен цел-
лобиогидролазами (ЦБГ1 и ЦБГ2, КФ 3.2.1.74), эндоглюканазами (ЭГ1, ЭГ2, ЭГ3, КФ 3.2.1.4), Р-глюкозидазой (БГЛ1, КФ 3.2.1.21), а также кси-ланазами (КСИЛ1, КСИЛ2 и КСИЛ3, КФ 3.2.1.8) [5, 6]. Совместное синергетическое действие этих ферментов обеспечивает конверсию растительного сырья до гексоз и пентоз.
Ферментные препараты (ФП) на основе грибов рода Trichoderma широко применяются в целлюлозно-бумажной, текстильной и пищевой отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве в качестве кормовых добавок [2—4]. Для создания коммерческих ФП необходимо наличие высокоактивных штаммов—продуцентов. При получении таких штаммов используются различные подходы: поиск новых уникальных микроорганизмов, оптимизация процессов их культивирования, создание с помощью методов классического мутагенеза штаммов с увеличенной продуктивностью ферментов [5—9]. Классический мутагенез не утратил своей актуальности и в настоящее время активно используется для получения новых
штаммов и коммерческих выгодных ФП, в последние десятилетия для этого активно применяются методы генетической инженерии [3, 10].
Цель работы — получение высокопродуктивных мутантов штамма-продуцента комплекса карбогидраз T. longibrachiatum TW1, их культивирование в ферментерах, а также анализ состава полученных новых ФП.
МЕТОДИКА
В работе использовали штамм T. longibrachiatum TW1 из Всероссийской коллекции микроорганизмов (№ F-3634D) [11].
В качестве питательных сред использовались:
1) глюкозо-картофельный агар, ГКА, (г/л): экстракт картофеля — 300, глюкоза — 10 и агар — 18;
2) селективная среда, СС (г/л): КН2РО4 — 1.5, (NH4)2SO4 - 0.6, MgSO4 • 7H2O - 0.3, CaCl2 - 0.1, FeSO4 • 7H2O - 0.02, MnSO4 • 5H2O - 0.018, ZnSO4 • • 7H2O - 0.02, 1% аморфной целлюлозы (АЦ), полученной путем обработки микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) Avicel РН101 ("Sigma", США) фосфорной кислотой, рН среды доводили до 4.5 1.0 М NaOH;
3) ферментационная среда для культивирования в колбах, ФСК, (г/л): КН2РО4 - 15.0; (NH4)2SO4 -
4.6; MgSO4
7H2O - 0.3;
FeSO4 • 7H2O - 0.02;
М^О4 • 5Н20 - 0.018; 2^О4 • 7Н20 - 0.02; СаС12 -0.3; кукурузный экстракт (сухого вещества — 37%) — 60.0; глюкоза - 20.0 и МКЦ М-18 ("МК-центр", Россия) - 20.0; рН доводили до 4.5 1 М ШОН;
4) ферментационная среда для культивирования в ферментерах, ФСФ, (г/л): глюкоза - 50.0; МКЦ М-18 - 5.0; кукурузный экстракт (сухого вещества - 37%) - 60.0; ^Н4)^О4 - 6.0; КН2РО4 -3.0; СаС12 - 0.3; М§8О4 • 7Н2О - 0.3; FeSO4 • 7Н2О -0.02; 2^О4 • 7Н2О - 0.02; М^О4 • 5Н2О - 0.02 пеногаситель "Пропинол" - 1.0;
5) среда для выращивания инокулята ИК, (г/л) глюкоза - 25.0; кукурузный экстракт (сухого вещества - 37%) - 45.0; ^Н4)^О4 - 4.6; КН2РО4 - 3.0 MgSO4 • 7Н2О - 0.3; СаС12 - 0.3; FeSO4 • 7Н2О -0.02; 2^О4 • 7Н2О - 0.02; М^О4 • 5Н2О - 0.02.
При культивировании в колбах суспензию спор (108 спор/мл) штамма Т. ¡ощМгаеЫаШш TW1 и мутантов засевали в 100 мл среды ФСК в колбах Эрленмейера объемом 700 мл. Культивирование проводили на роторной качалке при 220 об./мин 28°С в течение 144 ч. Пробы отбирали в стерильных условиях, отделяли культуральную жидкость (КЖ) от мицелия центрифугированием при 150 g. В КЖ определяли активность целлюлазы по отношению к карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), а также активность ксиланазы и содержание белка.
Инокуляционную культуру для засева в ферментер получали аналогичным образом на среде ИК в течение 24-36 ч.
Для культивирования в ферментерах исходный и мутантный штаммы засевали в ферментационную установку "КФ-108" (Россия), состоящую из четырех ферментеров рабочим объемом 0.8 л. Контроль параметров культивирования (28°С, рН 4.04.5, парциальное давление кислорода рО2 - 30% от насыщения, расход воздуха - 0.7 л/мин, скорость подачи 20%-ного раствора лактозы - 3.2 г/л • ч) осуществлялся в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения "Quadras" ("Проинтех", Россия). Продолжительность культивирования составляла 144 ч. Процесс ферментации протекал в две стадии. Первая стадия (до 24 ч) включала периодическое культивирование в режиме "batch", вторая (после 24 ч) - периодическое культивирование с внесением лактозы "fed-batch". Отбор проб осуществляли в стерильных условиях через специальный пробоотборник. Подготовку проб для биохимических анализов проводили так же, как при культивировании в колбах.
Для мутагенеза споры гриба, выросшего на поверхности скошенного ГКА, суспендировали в дистиллированной воде с добавлением Twin 80 (0.01%), фильтровали через стеклянный фильтр и подвергали мутагенной обработке на у-установке камерного типа ГУТ-200 М в РНЦ "Курчатовский институт" (Россия). Доза облучения составляла 1500 Гр, время обработки - 6 ч, температура облучения спор - 20-23°С, среда облучения -воздух. Для получения отдельных колоний после мутагенной обработки споры рассевали на чашки с ГКА в соответствующем разведении. Каждую из колоний стерильной зубочисткой переносили на селективные чашки с АЦ и культивировали в течение 4-6 сут при 28°С до образования зоны просветления вокруг колонии.
Для получения ФП ферментационную смесь после окончания ферментации центрифугировали при 100 g в течение 40 мин. КЖ лиофильно высушивали на сублимационной установке КС-30 (Чехия).
Для определения ферментативной активности КЖ и ФП использовали методы, описанные в [12]. В качестве субстратов для определения активности ферментов были использованы: натриевая соль КМЦ средней вязкости, глюкуронокси-лан березы, я-нитрофенил-Р^-глюкопиранозид (ПНФГ) и МКЦ. Активность ферментов по отношению к ПНФГ определяли по начальной скорости образования окрашенного продукта - п-нит-рофенола, концентрацию которого определяли спектрофотометрически при 400 нм. Реакцию проводили в 0.1 M Na-ацетатном буфере, pH 5.0 в течение 10 мин при 40°С. Концентрация субстрата составляла 0.05 M. Реакцию останавливали добавлением 1 M Na2CO3.
Активность ферментов по отношению к поли-сахаридным субстратам определяли по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС). Концентрацию ВС определяли методом Шомоди—Нельсона [12]. Реакцию проводили в 0.1 M Na-ацетатном буфере, рН 5.0 в течение 10 мин при 50°С. Концентрация полисахаридно-го субстрата в реакционной смеси составляла 5 г/л. При определении активности ферментов по отношению к нерастворимому субстрату МКЦ реакционную смесь перемешивали.
Активность ферментов выражали в международных единицах. За 1 единицу принимали то количество фермента, которое образовывало 1 мкмоль продукта за 1 мин.
Содержание белка определяли по методу Ло-ури [13], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Для разделения ферментов, присутствующих в ФП, использовали хроматографическую систему FPLC ("Pharmacia", Швеция). Обессоливание и замену буфера в образцах проводили в хромато-графической системе низкого давления Econo-System ("BioRad", США), на колонке (1 х 10 см) с акрилексом П2 ("Reanal", Венгрия), уравновешенным 20 мМ пиперазин-НС1-буфером, рН 5.5. Затем ФП наносили на колонку с сорбентом Mono Q HR 5/5 ("Pharmacia", Швеция), уравновешенную тем же буфером. Белки элюировал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.