МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 1, с. 109-118
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 631.46:579.8.017.735+547.211
КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫЕ МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ В ПОКРЫВАЮЩЕЙ ПОЧВЕ ПОЛИГОНА ТВЕРДЫХ
БЫТОВЫХ ОТХОДОВ
© 2014 г. А. Ю. Каллистова1, х, Л. Монтонен2, Г. Юргенс3, У. Мюнстер4, М. В. Кевбрина5, А. Н. Ножевникова1
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
2Факультет продовольствия и природопользования, Университет Хельсинки, Финляндия 3Факультет биотехнологии и химической технологии, Университет им. Х.А. Аалто, Эспоо, Финляндия 4Институт инженерии и биотехнологии окружающей среды, Технологический университет Тампере, Финляндия 5Инженерно-технологический центр ОАО "Мосводоканал", Москва Поступила в редакцию 20.12.2012 г.
В накопительных культурах, выделенных при 10°С из отобранных в период с апреля по ноябрь образцов покрывающей почвы полигона ТБО, идентифицированы метанотрофы, близкородственные психротолерантным представителям родов Methylobacter и Methylocella. В накопительных культурах, выделенных при 20°С из тех же образцов покрывающей почвы, обнаружены метанотрофы, близкородственные мезофильным представителям родов Methylobacter и Methylosinus. В накопительной культуре, выделенной при 40°С из покрывающей почвы, отобранной в мае (температура почвы 11.7—12.5°С), идентифицирован метанотроф, близкородственный термотолерантному виду Methy-localdum gracile. Помимо метанотрофов в накопительных культурах идентифицированы метилобак-терии родов Methylotenera и Methylovorus, а также представители родов Verrucomicrobium, Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Dokdonella и Candidatus Protochlamydia. В чистую культуру выделен метанотроф, близкородственный (98% сходства последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК) психротолерантному виду Methylobacter tundripaludum SV96. Интродукция выращенной при 15°C смеси выделенных культур метанотрофных бактерий в покрывающую почву полигона ТБО приводила к снижению эмиссии метана с поверхности опытного участка полигона осенью (октябрь, ноябрь). В использованном инокуляте подтверждено присутствие метанотрофов, близкородственных M. tundripaludum SV96.
Ключевые слова: аэробные метанотрофные бактерии (метанотрофы), психротолерантные метанотрофы, полигоны твердых бытовых отходов (ТБО), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ).
DOI: 10.7868/S0026365614010042
Аэробные метанотрофные бактерии (метанотрофы), использующие метан в качестве единственного источника углерода и энергии, играют ключевую роль в глобальном цикле метана, окисляя этот парниковый газ и препятствуя его эмиссии в атмосферу. Из природных и антропогенных экосистем выделены мезофильные, умерено термофильные, психротолерантные, психрофиль-ные, алкалофильные, галофильные, ацидофильные и термоацидофильные метанотрофы, классифицированные на основании анализа генов, кодирующих 16S рРНК [1—6].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kallistoanna@mail.ru).
Полигоны захоронения твердых бытовых отходов (ТБО) являются экологически опасными объектами и важными антропогенными источниками метана. На полигонах ТБО, в том числе на исследованном нами крупнейшем подмосковном полигоне ТБО "Хметьево", развивается плотная популяция метанотрофных бактерий, спонтанно заселяющих верхний аэробный слой антропогенной почвы [7—10]. На полигоне "Хметьево" зафиксирована крайне неоднородная эмиссия метана, достигавшая в отдельных точках полигона 10 г С м-2 ч-1 [7]. Показано, что метанокисляю-щая активность покрывающей почвы возрастала с началом весны, достигая максимума в теплый
сезон года (май—сентябрь). Эмиссия метана, наоборот, летом снижалась и резко увеличивалась осенью (октябрь—ноябрь) [8]. Численность мета-нотрофов (по данным метода CARD-FISH) была максимальной в теплый сезон года, положительно коррелируя с метанокисляющей активностью покрывающей почвы. Достаточно высокая численность метанотрофов в холодные сезоны года указывала на присутствие в покрывающей почве психротолерантных метанотрофов [9]. В покрывающей почве методом непрямой иммунофлуо-ресценции идентифицированы метанотрофы родов Methylomonas, Methylobacter, Methylocystis, Me-thylosinus и Methylocapsa [10].
В последние годы резко возросло количество работ, посвященных анализу состава метано-трофной популяции на полигонах ТБО методами молекулярной экологии. Общим свойством полигонов, независимо от их географического месторасположения (Германия, Великобритания, Ирландия, США, Канада, Китай) и разницы в физико-химических характеристиках почвы и отходов, являлось доминирование в покрывающей почве метанотрофов родов Methylobacter и Methylocystis. На полигонах ТБО также идентифицированы представители родов Methylosinus, Methylo-cella, Methylocapsa, Methylomonas, Methylomicrobi-um, Methy^a^^, Methylococcus, Methylocaldum, а также метанотрофы, близкородственные ацидофильным представителям типа Verrucomicrobia [11—20]. Исследован состав метанотрофной популяции покрывающей почвы в зависимости от покрывающей растительности [11], влажности [18, 20] и температуры [21] почвы, концентрации кислорода [20] и азота [13, 18, 20], соотношения C/N в органическом веществе почвы [17], присутствия летучих органических веществ [12], земляных червей [16], а также от сезона года [18, 19]. На полигоне ТБО, расположенном в Великобритании, в период с апреля по сентябрь в покрывающей почве выявлено доминирование метанотрофов рода Methylocystis; в апреле (при температуре почвы 5.4—17.8°С) и сентябре (9.5-19.2°С) в покрывающей почве обнаружены метанотрофы рода Methylocaldum, а в апреле и июне (11—20.4°С) — Methylococcus [18]. На полигоне ТБО, расположенном в Канаде, метанотрофная популяция верхнего почвенного слоя (0—0.1 м) была сильнее подвержена сезонным изменениям. Во всех образцах почвы доминировали метанотрофы родов Methylocaldum и Methylobacter. Максимальное видовое разнообразие и появление метанотрофных представителей родов Methylomicrobium, Methylomonas и Methylosarcina наблюдалось в период с октября по декабрь при температуре почвы 3.4— 11°С [19].
Целью настоящей работы являлось выделение накопительных культур психротолерантных ме-танотрофных бактерий из покрывающей почвы
полигона "Хметьево", отобранной в холодные (апрель, октябрь и ноябрь) и, для сравнения, в теплые (с мая по сентябрь) сезоны года, идентификация метанотрофов в накопительных культурах, а также исследование влияния интродукции биомассы психротолерантных метанотрофов на эмиссию метана с поверхности полигона ТБО в холодное время года (осень).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили образцы покрывающей почвы, отобранные на полигоне ТБО "Хметьево" (Солнечногорский район Московской обл.). Детальная характеристика полигона приведена в других публикациях [7—10]. Температуру покрывающей почвы измеряли с помощью температурных датчиков ("Dallas Semiconductor", США) [9]. Образцы покрывающей почвы отбирали буром Измаильского с глубин 0—20 и 20—40 см в бесснежный период (с начала апреля по конец ноября). Зимой (декабрь—март) пробы почвы не отбирали, т.к. почвенный слой был покрыт снегом и промерзал, а места протаивания были непроходимы.
Метанокисляющую активность определяли, как описано ранее [10], в водных почвенных суспензиях, приготовленных из образца почвы, отобранного в мае с глубины 20—40 см. Инкубацию почвенных суспензий проводили при 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50 и 60°С. Концентрацию метана измеряли каждые 24 часа на ГХ Хром-5 (Чехия), используя детектор по теплопроводности и активированный уголь АГ-3 в качестве сорбента. Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности. Начальную метанокисляющую активность рассчитывали по убыли метана в первые 1—3 сут с начала инкубации и выражали в мкмоль СН4 г-1 асм (абсолютно сухой массы) почвы сут-1. Абсолютно сухую массу (асм) почвы определяли после высушивания образцов до постоянной массы при 105°C.
Накопительные культуры метанотрофов выделяли из образцов покрывающей почвы в экспериментальных точках, для которых была показана высокая скорость окисления метана [10]. Почву отбирали из верхнего слоя (0-20 см) в теплые (июль, сентябрь) и холодные (апрель, октябрь, ноябрь) сезоны года (табл. 1). Из одних и тех же образцов почвы параллельно получали накопительные культуры при 10 и 20°С в жидкой минеральной среде "П" [22] с содержанием метана в газовой фазе 10 об. %. Также накопительные культуры получали при 5 и 40°С из почвенных суспензий, в которых определяли метанокисляющую активность. Почву, отобранную в октябре из экспериментальной точки 6, использовали для получения накопительных культур метанотрофов при 10 и 20°С и
Таблица 1. Условия выделения накопительных культур метанотрофных бактерий
Время отбора образца почвы Образец почвы, № Температура выделения, oC Концентрация метана, % Полученные накопительные культуры, №
Апрель 4 10, 20 10 4/10, 4/20
Май 10, 11 5 40 10 10 10/5 11/40
Июль 2 10, 20 10 2/10, 2/20
Сентябрь 5 10, 20 10 5/10, 5/20
Октябрь 7 8 9 10, 20 10, 20 10, 20 5 10 50 7/10, 7/20 8/10, 8/20 9/10, 9/20
Ноябрь 3 10, 20 10 3/10, 3/20
концентрациях метана 5, 10 и 50 об. %. Точка 6 характеризовалась высокой концентрацией метана (35—60 об. %) в поровом газе на глубине 20—60 см и резким ее снижением до нуля в приповерхностном слое, а также высокой эмиссией метана в апреле, мае и ноябре и отсутствием эмиссии или потреблением метана из приземного воздуха в период с июня по октябрь [7].
Для получения накопительных культур готовили почвенные суспензии из свежеотобранных образцов покрывающей почвы (рН 6.8—7.3) [10]. Производили 10%-ный засев суспензией 60-мл флаконов с 10 мл стерильной среды "П" и соответствующей концентрацией метана в газовой фазе (5, 10 или 50 об. %). Флаконы инкубировали статически в темноте при соответствующих температурах (5, 10, 20 и 40°С). Бактериальный рост оценивали качественно по появлению мутности и пленок в среде. О росте метанотрофов судили по убыли из газовой фазы внесенного метана; концентрацию метана измеряли на ГХ Хром-5 (Чехия). Накопительные культуры пересевали каждые
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.