БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 420-433
УДК 576.312.6
КУЛЬТУРА КЛЕТОК И КАРИОТИП САХАЛИНСКОГО ОСЕТРА
Acipenser mikadoi
© 2008 г. X. С. Вишнякова, Н. С. Мшге*, Д. А. Зеленина*, Е. В. Микодина*, О. А. Ковалева**, Г. В. Мадан***, Е. Е. Егоров
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, д. 32; электронная почта: yegorov@eimb.ru; yegorov58@mail.ru *Всероссийский научно-исследователъский институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО), 107140
Москва, ул. В. Красноселъская, д. 17 ** Федералъное государственное учреждение "Централъное управление по рыбохозяйственной экспертизе и нормативам по сохранению, воспроизводству водных биологических ресурсов и акклиматизации" (ФГУ
"ЦУРЭН"), 125009 Москва, Б. Кисловский пер., д. 10 ***Московский физико-технический институт, 141700 Долгопрудный, Моск. обл., Институтский пер., д. 9
Поступила в редакцию 18.07.2008 г.
Культура клеток сахалинского осетра Acipenser mikadoi, представляющего собой редкий исчезающий вид, была получена из фрагмента грудного плавника с захватом прилежащих мягких тканей. На начальном этапе роста культура состояла из клеток разных типов, среди которых можно было выделить как типичные фибробласты, так и клетки эпителиального происхождения, миофиброб-ласты и др. После примерно пяти пересевов в культуре стали преобладать клетки фибробластной морфологии. Эти клетки росли с постоянной скоростью более года, пройдя за это время около 80 удвоений популяции. В отсутствие сыворотки клетки переходили в пролиферативный покой (00-по-кой). При длительном пребывании без замены среды клетки сливались, образуя мышечные волокна длиной несколько сантиметров. Эти волокна могли ветвиться и со временем приобретали поперечную исчерченность. Примерно через 40 дней после возникновения волокна подвергались обратной инволюции: теряли форму, откреплялись от субстрата и погибали. Индукция адипогенной дифференцировки приводила к прекращению пролиферации и появлению в незначительной части клеток липофильных включений. Количество этих включений было ограничено, клетки с включениями имели разнообразную морфологию и не были похожи на адипоциты. Индукция остеогенной дифференцировки приводила к появлению клеток, продуцирующих минерализованный внеклеточный матрикс и к образованию костных узелков. Хромосомный анализ выявил типичный для ряда видов осетров набор хромосом. Вариабельность количества хромосом оказалась очень высокой (в среднем 247 ± 33 при моде в 248 хромосом). С помощью GC- и АТ-специфичных флуорохромов обнаружено, что теломерные и центромерные районы всех хромосом обогащены GC-повторами. Обнаружена гетерогенность по распределению AT- и GC-богатых последовательностей между хромосомами. Длинные хромосомы преимущественно окрашиваются AT-специфичным флуорохромом, а мелкие сильнее флуоресцируют при обработке 7-аминоактиномицином D. Несколько мелких хромосом отличаются особенно яркой флуоресценцией при окрашивании этим флуорохромом. Работа представляет собой первый опыт получения культуры клеток сахалинского осетра и анализа его ка-риотипа.
Сахалинский осетр Аырвтвг ш1каЛо1 - редкий вид осетровых, находящийся под угрозой исчезновения. Он включен в Красную книгу Международного союза охраны природы (МСОП). Единственным естественным нерестилищем сахалинского осетра является в настоящее время река Тумнин (Датта), впадающая в Татарский пролив в 49°17' СШ и 140°22' ВД [1, 2]. В 2001 г. Центробанк России выпустил памятную монету, посвященную сахалинскому осетру (рис. 1).
В начале - середине XX века сахалинский осетр часто встречался по всему Японскому морю, от берегов Китая и Японии и до Приморского и Хабаровского краев Российского Дальнего Востока. В
августе на рыбных рынках Саппоро преобладали молодые сахалинские осетры (35-54 см), а позднее - половозрелые особи длиной 170 см и более, которых вылавливали в крупных японских реках Ишикари и Тишио на о. Хоккайдо [1]. К 1980 г. сахалинский осетр перестал нереститься в реках Японии, однако незрелые особи этого вида продолжают встречаться в морских акваториях, омывающих о. Хоккайдо [1]. Естественный нерест сахалинского осетра в реках Сахалина в настоящее время не отмечен.
Редкие дикие особи и существующее маточное стадо (Охотский лососевый рыбоводный завод, о. Сахалин, пос. Мальки [2]) представляют собой
основу для сохранения генофонда этого вида. Альтернативными способами сохранения генома могут быть криоконсервирование спермы, а также живая культура клеток. Криоконсервация спермы сахалинского осетра была осуществлена в начале 90-х годов XX века [3], образцы замороженной спермы этого вида хранятся в криобанке спермы хозяйственно ценных видов рыб Всероссийского научно-исследовательского института пресноводного рыбного хозяйства (ВНИИПРХ) [4].
Особый интерес к А. ш1кайо1 объясняется тем, что по литературным данным его клетки содержат в 2-4 раза больше ДНК, чем у других близкородственных видов [5]. Высказано мнение, что А. ш1-каёог - это гексадекаплоидный или октоплоидный вид, в зависимости от точки зрения на размер диплоидного набора осетровых [6].
В мире уже несколько раз получали культуры клеток осетровых [7, 8]. Культуры клеток рыб можно использовать для тестирования специфических вирусов (например, иридовируса), которые могут наносить существенный вред аквакультуре [9].
Осетры являются не очень удобным объектом разведения. Во-первых, они довольно медленно растут и достигают половой зрелости. Во-вторых, достаточно трудно определить пол рыбы. Генетика пола пока не разработана. Все это приводит к дополнительным сложностям. Однако увеличение антропогенной нагрузки (загрязнение рек, уменьшение возможного ареала обитания и хищнический промысел) обуславливает необходимость развития аквакультуры осетровых. Для уменьшения возможных издержек необходимо глубокое изучение биологии осетра, создание тест-культур клеток, разработка генетики пола.
В данной работе мы ставили цель получить дол-гоживущую культуру клеток сахалинского осетра и оценить количество хромосом в его клетках. Для подтверждения видовой принадлежности и уточнения филогенетического положения осетра-донора клеток проведено секвенирование проб ДНК, полученных от разных видов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Происхождение исследуемого образца сахалинского осетра. В 1991 г. специалистами ФГУ "Приморрыбвод" совместно с сотрудниками Центральной лаборатории Главрыбвода от пары выловленных в р. Тумнин диких производителей была получена оплодотворенная икра [10, 11]. В том же году развивающиеся эмбрионы были перевезены на Охотский лососевый рыбоводный завод (о. Сахалин, пос. Мальки), где дали начало существующему ныне маточному стаду [2]. В 2005 г. в условиях Охотского рыбоводного завода (о. Сахалин) от дикой самки (РНКЭГМ# М1к21), также вылов-
Рис. 1. Монета с изображением сахалинского осетра.
ленной в р. Тумнин, и 14-летнего самца из маточного стада было вновь получено потомство [12]. Для получения настоящей культуры клеток сахалинского осетра использовали ткани от одной особи в возрасте 1 г. С этой целью один из годовиков, выращенных на Охотском заводе, летом 2006 г. был доставлен в аквариальную ВНИРО (г. Москва) и впоследствии передан в ИМБ РАН.
Секвенирование митохондриальной ДНК и построение филогенетического дерева. Анализировали образцы тканей, полученные от различных видов осетровых (таблица). Выделяли ДНК стандартным солевым методом с лизированием протеи-назой К [13]. Полноразмерные последовательности контрольного региона (D-loop) митохондриальной ДНК (мтДНК) амплифицировали с использованием праймеров LproF (5'-AACTCTCACCCCTAGCTC-CCAAAG-3') и DL651 (5'-ATCTTAAC ATCT-TCAGTG-3'), комплементарным участкам, граничащим с контрольным регионом генов транспортных РНК (tPro и tPhe). Амплификацию проводили в стандартных условиях при температуре отжига 52°С [14]. Длина продукта варьировала от 950 до 1280 п.н. в зависимости от числа присутствующих в гаплотипе 82-нуклеотидных повторов, а также от видовой принадлежности образца.
Секвенирование проводили с тех же праймеров, что и ПЦР, на автоматическом секвенаторе ABI 3100 c использованием набора для секвенирования BigDye v.1.1. Часть особей имела полиморфизм по числу 82-нуклеотидных повторов на 3'-участке контрольного региона (граничащего с тРНК про-лина). Чтобы избежать наложения чтения нуклео-тидной последовательности с матрицы, имеющей разное число повторов, применяли праймер AHR3 (5'-CATACCATAATGTTTCATCTACC-3'), комплементарный участку непосредственно перед повторяющимся фрагментом.
Выравнивание и сборку контигов проводили путем анализа хроматограмм в программе SeqMan, множественное выравнивание - в программе MegAlign, праймеры разрабатывали с помощью
Источники генетического материала и последовательностей контрольного региона митохондриальной ДНК (мтДНК) (ОепЪапк) для построения филогенетического дерева
Видовая принадлежность осетровых № из коллекции Genbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov № из коллекции РНКЭГМ (ВНИРО) Происхождение биологического материала
Сахалинский осетр A. mikadoi Mik07-16 (2003 г.) Mik22-24 (2006 г.) Mik17-18 (2003 г.) Mik19-21 (2005 г.) Охотский лососевый рыбоводный завод (Охотский ЛРЗ) р. Тумнин
Амурский осетр A. schrenckii SCH07-11 р. Амур
Калуга Huso dauricus DAU42, 43, 60, 63.12, 61, 05 р. Амур
Сибирский осетр A. baeri BAE158 р. Обь
Русский осетр A. gueldenstaedti GUE2183 Каспийское море
Зеленый осетр A. medirostris U30728 (Med Amerl) L01509 (Med Amer2) AF184106 (Med Amer3) Север американского побережья Тихого океана
Зеленый осетр A. medirostris* AF362130 (Med Asian) Азиатское побережье Тихого океана
Белый осетр A. transmontanus X54348 (Transm54) AF184108 (Transm18) NC004743 (Transm00) Реки западного побережья северной Америки
* ОепЪапк называет сахалинского осетра зеленым согласно номенклатуре, принятой СИТЕС (Конвенция по международной торговле вымирающими видами дикой фауны и флоры), связанной с давними спорами, является ли сахалинский осетр самостоятельным видом либо подвидом зеленого (швйиозгтгз) осетра.
программы PrimerSele
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.