ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 2, с. 271-276
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575:578:57.017.23
КУЛЬТУРА КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ ДЕНСОВИРУСОВ
© 2015 г. Е. Н. Козлов, Д. В. Муха
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 e-mail: ugin.sfu@gmail.com; dmitryVmukha@gmail.com Поступила в редакцию 04.09.2014 г.
Проведено исследование внутриклеточной локализации слитого гибридного белка, состоящего из двух частей: зеленого флуоресцентного белка (GFP) (N-концевая часть) и одного из капсидных белков VP1 (С-концевая часть) денсовируса рыжего таракана BgDVl в пересеваемой культуре клеток человека HeLa. В контрольной серии экспериментов анализировали внутриклеточную локализацию GFP. Показано, что в результате транзиторной экспрессии соответствующих векторных конструкций гибридный белок локализуется строго в ядрах клеток HeLa, в то время как GFP локализуется как в ядре, так и цитоплазме трансфицированных клеток. Можно заключить, что сигнал ядерной локализации капсидного белка VP1 денсовируса рыжего таракана функционально активен не только в клетках этого насекомого, но и в пересеваемой культуре клеток человека. Данное наблюдение расширяет экспериментальные возможности для изучения генетического контроля внутриклеточного трафика капсидных белков денсовирусов.
DOI: 10.7868/S0016675815020113
Семейство вирусов Parvoviridae включает в себя два подсемейства: Parvovirinae, представители которого инфицируют позвоночных животных и человека, и подсемейство Densovirinae, представители которого инфицируют беспозвоночных животных. Подсемейство Densovirinae подразделено на пять родов: Ambidensovirus, Brevidensovirus, Hepandensovirus, Iteradensovirus, Penstyldensovirus; к настоящему времени описано около 40 видов этого подсемейства [1]. В отечественной научной литературе вирусы подсемейства Densovirinae называют денсовирусами. По структуре генома и особенностям жизненного цикла денсовирусы родственны представителям подсемейства Par-vovirinae и поэтому являются удобными модельными объектами для изучения патологических процессов, вызываемых вирусами этого подсемейства, представляющими опасность для человека, сельскохозяйственных и домашних животных [2]. Кроме того, денсовирусы представляют особый интерес, поскольку некоторые из них могут инфицировать беспозвоночных животных, имеющих экономическое значение, например, Lepidopteran iteradensovirus способен вызывать эпидемии, уничтожая культуры тутового шелкопряда, а Decapod hepandensovirus вызывает смертельные заболевания промысловых креветок. Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет денсовирус BgDVl, вызывающий смертельные патологии у рыжего таракана Blattella germanica — синантропного вида насекомых, представ-
ляющего, как известно, значительную опасность для человека [3].
Денсовирус рыжего таракана (Б§ПУ1) был открыт относительно недавно [3]. К настоящему времени детально описана структура и стратегия экспрессии генома этого вируса [4]. Показано, что геном Б§ПУ1 имеет размер 5335 пн. Капсиды этого вируса содержат одноцепочечные линейные молекулы ДНК; примерно половина вирусных частиц содержит "+" цепи, вторая половина "—" цепи ДНК. При выделении тотальной ДНК в растворах с большой ионной силой происходит формирование двухцепочечной ДНК. Показано, что геном Б§ПУ1 содержит шесть открытых рамок считывания, две из которых (OR.F1 и ОЯР2) соответствуют белкам капсида, а ORF3, ORF4 и ORF5 — регуляторным белкам. Функциональная роль шестой рамки считывания остается неизвестной.
Экспрессия белков вирусного капсида происходит с двух транскриптов размером 2374 (белки УР1 и УР3) и 2603 нуклеотидов (белок УР2). Первый транскрипт представляет собой результат сплайсинга, при котором вырезается фрагмент РНК с 4121-го по 4491-й нуклеотид, при этом объединяются две открытые рамки считывания ORF1 и ORF2. Белок УР2 транслируется с не-сплайсированной РНК (2603 н), которая полностью соответствует ORF1. Белки капсида УР1 (97 кДа), УР2 (80 кДа) имеют общий С-концевой участок, полностью соответствующий белку УР3 (57 кДа),
и уникальные N-концевые участки (рис. 1). Показано, что примерно половина белков VP2 подвергается моноубиквитинированию [4].
В жизненном цикле денсовирусов можно выделить ряд стадий, совокупность которых позволяет вирусу успешно реализовывать свою генетическую программу. Такими стадиями являются взаимодействие вируса с мембраной, проникновение внутрь клетки, транспорт через цитоплазму к ядру, проникновение генетического материала вируса в ядро, репликация вирусной ДНК, транскрипция и трансляция вирусных генов, самосборка вирусных частиц и их выход из клетки хозяина [5—7].
Известно, что репликация вирусной ДНК и формирование вирусных частиц денсовирусов происходят в ядре [8, 9]. Однако механизм выхода вирусных частиц из ядра остается непознанным. Денсовирусы являются одними из наиболее мелких из описанных к настоящему времени вирусов — размер вирусных частиц равен 18—20 нм. Столь малый размер сопоставим с размером ядерных пор, что позволяет предположить трафик вирусных частиц денсовируса через ядерные поры без разрушения ядра клетки [10].
Очевидно, что как в проникновении синтезированных в цитоплазме капсидных белков денсо-вируса в ядро клетки, так и в выходе сформированных вирусных частиц через ядерные поры в цитоплазму ключевую роль должны играть сигналы ядерной локализации (NLS) и ядерного экспорта (NES), являющиеся составной частью аминокислотных последовательностей капсидных белков большинства денсовирусов.
Основной проблемой в изучении внутриклеточного трафика как капсидных белков, так и сформированных вирусных частиц денсовирусов является отсутствие удобной модельной системы. Понятно, что наиболее адекватной моделью может являться пересеваемая клеточная культура, полученная из организма-хозяина соответствующего вируса. Однако не из каждого организма можно получить стабильную пересеваемую клеточную культуру, более того, далеко не каждая клеточная культура удобна для проведения моле-кулярно-генетических манипуляций, например трансфекции клеток. Одним из выходов из описанной ситуации, с нашей точки зрения, может являться использование гетерологичных клеточных систем, которые легко поддерживаются в лабораторных условиях и с успехом используются для молекулярно-генетических исследований, например культуры клеток млекопитающих. Однако данное предположение требует экспериментальной проверки, поскольку, с одной стороны, млекопитающие значительно эволюционно уда-
лены от организмов-хозяев денсовирусов, с другой стороны — известно, что сигналы ядерной локализации и ядерного экспорта являются эволю-ционно консервативными структурами.
Целью данного исследования являлась проверка возможности использовать пересеваемую культуру клеток человека HeLa для изучения внутриклеточного трафика капсидных белков денсовируса рыжего таракана.
Посредством программы wolfpsort (http:// www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) в С-кон-цевой части всех трех капсидных белков BgDVl предсказан двухчастный сигнал ядерной локализации (PTKKNKP 290-297 аа, KKWK 347-351 аа), а в уникальном N-концевом участке белка VP2 — сигнал выхода из ядра (ELDRLL 64-69 аа) (рис. 1).
Ранее при изучении пересеваемой культуры клеток рыжего таракана, инфицированных вирусом BgDVl, было показано, что белок VP1 имеет ядерную локализацию [4]. В рамках данной работы нами описана внутриклеточная локализация белка VP1 в процессе транзиторной экспрессии кДНК, соответствующей этому белку, в пересеваемой культуре клеток человека HeLa.
кДНК, соответствующая белку VP1, была нами ранее клонирована в вектор pGEM-T-Easy (Promega). Для получения векторной конструкции, необходимой для трансфекции культуры клеток HeLa, ранее клонированный фрагмент ам-плифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, фланкирующих заданный участок ДНК. Ампли-фицированный фрагмент ДНК клонировали в вектор pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO (Invitrogene). В результате была получена векторная конструкция, позволяющая экспрессировать под контролем промотора цитомегаловируса в пересеваемой культуре клеток человека HeLa слитый гибридный белок, состоящий из двух частей: зеленого флуоресцентного белка (GFP) (N-концевая часть) и VP1 (С-концевая часть). В качестве контроля в данном эксперименте использовали коммерческую плазмиду pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO (Invitrogene), позволяющую экспрессировать под контролем промотора цитомегаловируса белок GFP. Известно, что белок GFP (в отличие от белка VP1) не содержит в своем составе сигнал ядерной локализации и, как следствие, равномерно распределяется по всему объему клетки [11]. Предполагалось, что сравнительный анализ внутриклеточной локализации этих двух белков позволит сделать вывод о функциональной активности сигнала ядерной локализации капсидного белка VP1 в эволюционно удаленных от насекомых клетках HeLa.
>VP1
MSTSGLESVPLLPVNSATVEYGGIEPKVHSGYGASRLPVKPTSAAGGAGAQYDKIFQSQLGRAASSGNPLHVFKSRDE
YYNSVPWELRRLPFAERDRLIKPYGVfCWDKVSKAQYAQHWKLVNPRAGQKRIQQGIVLPFSNNIGPGNTIQDAKTGSD
FIAQGHDIHYSEAKSDIDIQRADTEAIGQFIQEATHSHNPISQTQGVIGAVGLAGKQLVEKLTGKVQYGSPQQSQGGT
SMS ЕЮ PVAGP S SR P D PV PAQLPVQP ST IQE F AQTMSAPEAIVTGKRGAEE PD SAS TPTKTOJKPSEHSGSRL PG
TSGNTDGSMGSSTMLDLDASRGIMPISRGIHVEKFEWTFTKKWKFLSFGVADVILPDDIGTTTAPAKRWA
LTTSLVNIPWEYAFMYMSFAEFNRLREMTGVFATDCDIKIYQYNPRVAFQTADTNSTQATLNQNKFTRIA
KGLRNNPH L FG SD RDY T F S S D E PMK PLGFE TNAD Q Y T GQKFRD RL S KEMYGTT TRTTNT PTVPAISTGKE
MGLLRYYTVYASQTIDSGFPQYNKYCSEFNSMDLIGKQVLSAHHDFKYAPLTTRARHYQDSIYLPGDIPE
KKESQPANVVIPAGSKIVDLQSVRMPSTGFSAVEGANSRKEDAMTLGHLQVGGVDLKTGEALSNSTFTDF
D T L Y TKF PME QGG L YNEAGY Q GAT С GD QE S L HVGVRAV PKL GTAVNT INAS S WL D CQMYWTVE CRLRCV S
TEPFTYPRGNVSDIPLRSQFTAATKTAPMLQTFDRPYFYGKPQRVLNSVEL
>VP2
M PVN YNKPP PYERPNWE RMNEGQRRYAMEQYNLALVRRGQY FE PPIAARPPS PAPNNAIQDL DEL DR IiL DN F PI GS P OOSOGGTSHS DOPVAGP SSRPD PVPAOLPVOPS TIOEPAOTMSAPEAIVTGKRGAE E PD SAST PTKKNKPSEH 3 GSALPGTSGNTDGSMGSSTMLDLDASRGIMPISRGIHVEKFEWTFTKKWKFLSFGVADVILPDDIGTTTA PAKRWALTTSLV
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.