БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 941-946
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.3
ЛАМЕЛЛЯРНЫЕ ВКЛЮЧЕНИЯ ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ГРЫЗУНОВ C ДНЕВНЫМ ТИПОМ СУТОЧНОЙ АКТИВНОСТИ
© 2015 г. Н.В. Самосудова, О.Ю. Орлов, С.А. Голышев*
Институт проблем передачи информации им. А .А. Xаркевича РАН, 127051, Москва, Большой Каретный пер.,19/1
E-mail: п№то$@и1р.ги
*Институт физико-xимической биологии им А .Н. Белозерского Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1/2 E-mail: sergei.golyshev@genebee.msu.ru Поступила в p едакцию 09.07.15 г.
Пpедcтавлена ультpаcтpуктуpа пигментного эпителия полевки Бpандта, грызуна c дневным типом cуточной активности, соотносительно c известными процессами, пpоиcxодящими в пигментном эпителии: 1) поступлением отделенных от фоторецепторных мембран наружных сегментов и 2) перевариванием их в фагосомах пигментного эпителия. Для выявления мие-лоидных тел была использована фаза смены светового режима: световой (200 лк, 4 ч) на темновую (0,1 лк, 1,5 ч). В цитоплазме пигментного эпителия полевки миелоидные тела не были найдены, однако были обнаружены так называемые ламеллярные включения, которые по своим размерам отличаются от миелоидных тел. Описана их структура, даны размеры (от 200 до 400 нм) и местоположение. К роме того, выявлено наличие структур, предположительно отвечающих за транспорт переработанного материала. В пользу этого свидетельствует присутствие в апикальных отростках: 1) пигментного эпителия пузырьков с плотным, зернистым содержимым и 2) микротрубочек, осуществляющих транспорт «груза» в клетках.
Ключевые слова: пигментный эпителий сетчатки, мультиламеллярные включения, внутриклеточный транспорт, пузырьки, микротрубочки.
Пигментный эпителий (ПЭ), располагающийся между сетчаткой и хороидом, представляет собой монослой, состоящий, как и сетчат -ка, из клеток нейроэктодермального происхо-ждения. Он выполняет множество функций, которые весьма существенны для работы сетчатки глаза в целом. Прежде всего, это транспорт электролитов и воды из сублатерального про -странства в хороид, а также доставка глюкозы, аскорбиновой кислоты, ретинола, жирных кислот и ДНК к фоторецептор ам, что важно для зрительной функции. Разные вещества пер ено -сятся разными транспортерами. К другим функциям, которые выполняет ПЭ, относятся: абсорбция света и защита сетчатки от фотоокисления; секр еция нужных веществ для структурной целостности сетчатки; фагоцитоз отщепленных фоторецепторных мембран. По сути дела ПЭ является гематоретинальным барьером [1,2], который осуществляет контроль поступающих жидкостей, стабилизирует ионный со -став в области фоторецепторов, что существен-
Сокращение: ПЭ - пигментный эпителий.
но для фоторецепто рной возбудимости. Таким обр азом, ПЭ играет главную роль в поддержании нормальных функций сетчатки. Как транспортная функция ПЭ, так и фагоцитоз относятся к теме настоящей статьи, которая является пр одолжением нашей предыдущей ра -боты [3], также касающейся зрения грызуна с дневным типом суточной активности (желтой пеструшки). Следует отметить, что этот тип зрения сходен с типом зрения человека.
Процесс регулярного отчленения пачек дисков наружных сегментов и переваривание их в фагосомах происходит в связи с суточным циклом светового режима и последующей транспортировкой внутрь клеток ПЭ. В цитоплазме ПЭ отчлененные наружные сегменты перевариваются в образующихся фагосомах с участием лизосо-мальных ферментов - кислой фосфатазы [4] и ферментов пероксисом [5]. Переработанный материал (в виде липидов и белков) подлежит обратной транспортировке из клеток ПЭ к фоторецепторам для образования новых дисков в основании наружных сегментов. Отдельные фазы этого цикла разнесены во времени, поэтому одной из проблем ПЭ является временное депониро-
вание продуктов фагоцитоза, а именно значительной массы липидной фракции в соответствии с доминированием этого основного компонента клеточных мембран. В клетках ПЭ низших позвоночных и отчасти у высших, наблюдается образование так называемых миело-идных тел, выполняющих роль структур, в которых временно депонированы липиды. Цитоплазма ПЭ млекопитающих изобилует разного рода включениями, но типичных миелоидных тел среди них фактически не найдено [6]. Поскольку липидная составляющая фагоцитоза о с-тается главной и для млекопитающих, возникает вопрос о возможной форме временного депонирования липидов в пигментном эпителии грызунов.
В связи с этим задача данной работы со -стояла в поиске временных хранилищ продуктов фагоцитоза нар ужны х сегментов: либо мие-лоидных тел, либо структур, эквивалентных им, при оптимальном для этой цели световом р е-жиме эксперимента. Помимо этого, поскольку переработанный фагосомами материал наружных сегментов должен снова переправляться к фоторецепторам, возникает вопрос о его транспорте.
МЕТОДИКА
Живой материал (полевка Брандта) был отобр ан из животных виварной культуры. Известно, что световой р ежим влияет как на отделение наружных сегментов, так и на процессы, происходящие в апикальной зоне ПЭ, в частности на формирование миелоидных тел. Поэтому для повышения шансов обнаружить миелоидные тела использовали изменение светового режима: 4 ч животные находились на свету, а затем их помещали в темноту и через 1,5 ч фиксировали. Животных умерщвляли летальной дозой уретана. Затем с помощью шприца делали пр едвар ительную перфузию глаз 2,5% раствором глутарового альдегида, пр иготовлен-ного на 0,1 М Ка-какодилатном буфере. Это предохраняет сетчатку и ПЭ (кр айне мягкие у полевок) от превращения их в бесформенный комок. После дополнительной фиксации передние среды удаляли, а глазной бокал использовали для дальнейшей обработки. Фиксацию глазного бокала (в течение 1 ч пр и 4°С) осуществляли также 2,5% раствором глутарового альдегида, пр иготовленном на 0,1 М Ка-како-дилатном буфере (рН 7,2), содержащем 3% са -хар озы. Далее материал фиксировали в 1% 0804 (рН 7,2) в том же буфере, в течение 1 ч при 4°С. Материал последовательно обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентра-
ции, абсолютном спирте и ацетоне, а затем заключали в смесь эпон-ар алдит. Срезы окра -шивали уранилацетатом и цитратом свинца. П ро смотр срезов делали на электронном микроскопе JEM 100SX при ускоряющем напряжении 90 кВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В режиме изменения света на темноту пигментный эпителий гр ызуна был зафиксирован согласно приведенной методике. Известно [7], что миелоидные тела на свету очень быстр о исчезают из цитоплазмы, поэтому многие исследователи проводили фиксацию в темноте. В нашем случае, несмотря на то что материал фиксировали в темноте, не удалось обнаружить «типичные» миелоидные тела. Однако в настоящей работе у полевки Брандта наблюдали в цитоплазме ПЭ спирально закрученные мембранные структуры с небольшим числом витков, которые напоминали мультиламеллярные тельца, ранее описанные у крыс [4].
На рис. 1а представлен общий вид среза части пигментного эпителия полевки. На нем среди меланосом видна полуразрушенная фа-голизасома с двумя включениями. На рис. 1б показана та же фаголизосома при большем увеличении. В центре ее - два ламиллярных тельца. Более продвинута в своем развитии ламеллярная структура ЛТ-1. Ее образование происходит на основе мембранного материала цистерн гладкого эндоплазматического ретику-лума; наслоение мембран, по-видимому, осуществляется от края к центру. Вто рое тельце (ЛТ-2) - такое же по своей природе образование, также подтверждающее начало мембранного наслоения от края к центру. При этом участие гладкого эндоплазматического ретикулума в формировании спир альной структур ы подтверждает существующее в литератур е представление об образовании мультиламеллярных тел на основе цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума [8]. Размер ы ЛТ-1 ~400 нм; а ЛТ-2 -~300 нм. Рядом с ламеллярными тельцами видна лизосомальная гранула, пр исутствует шеро -ховатый эндоплазматический ретикулум.
На рис. 2 показано фор мирование спирально закрученного ламеллярного тельца внутри вакуоли. Рис. 2а представляет общий вид цитоплазмы ПЭ: видны меланосомы, вакуоль, внутри которой происходит зарождение ламел-ляр ного тельца (ЛТ-3). В о снове его образования также гладкий эндоплазматический ретикулум, располагающийся по краю вакуоли. Из цистерн этого ретикулума образуется структура, похожая на «ленту» (рис. 2б), которая закру-
Рис. 1. Цитоплазма пигментного эпителия. (а) - Общий вид части цитоплазмы ПЭ: фаголизасома (ФЛ) с двумя ламеллярными тельцами (ЛТ), меланосомы (М), лизосомальная гранула (Лгр). (б) - Фаголизасома с ламеллярными тельцами при большем увеличении: ЛТ-1 - спиральная структура, закрученная от края к центру, размер ~ 400 нм; ЛТ-2 - начало образования спирали, размер ~300 нм. В основе спиралей - преобразованные цистерны гладкого эндоплазматического ретикулума (стрелки). Рядом с фаголизасомой - шероховатый эндо-плазматический ретикулум (ШЭР).
чивается в спир аль. Рис. 2в (пр и большем увеличении) также демонстрирует спир аль, образующую ламиллярное тельце ЛТ-3. Размер ла-меллярного тельца ~200 нм, размер вакуоли, в котором развивается ламеллярная структура, -от ~700 до 600 нм. Сравнение наших данных с литературными показывает, что у белой крысы [4] также были найдены подобные мульти-ламеллярные тела разной формы и размера (от 2 мкм до 400 нм в диаметре) при фиксации материала 1 ч спустя после наступления темноты.
Кроме ламеллярных телец в цитоплазме ПЭ были выявлены структуры, которые могут являться «транспортными средствами», осуществляющими перено с веществ, обр азующихся после переваривания наружных сегментов в фа-госомах (рис. 3). Эти вещества представляют собой плотный осадок, наблюдаемый в цитоплазме апикальных отростков. Кроме того, осадок концентрируется в пузырьках, также располагающихся в апикальных отростках, где они собр аны вместе и «плотно» окружены мембра -ной апикальных отростков, напоминая «мешки». На р ис. 3а при малом увеличении видны три таких «мешка»: № 1, № 2 и № 3. В «мешке» №3 пр и более высоком увеличении видны пузырьки, наполненные плотным матери
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.