БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 5, с. 352-363
УДК 577.352.4
ЛАТЕРАЛЬНЫЙ ТРАНСПОРТ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИ АКТИВНОГО ИНТЕРМЕДИАТА В ПОКОЕ И ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ КЛЕТОК Chara
© 2014 г. А. А. Булычев*, А. В. Комарова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12; *электронная почта: bulychev@biophys.msu.ru Поступила в редакцию 28.05.2014 г.
Течение цитоплазмы жизненно необходимо для клеток растений, однако его связь с функциональными свойствами клетки практически не раскрыта. Микрофлуорометрия хлоропластов in vivo и измерения pH на поверхности клетки при локальном освещении участков, расположенных выше по течению цитоплазмы на расстоянии нескольких миллиметров от анализируемой области, представляют сравнительно новый подход к выявлению роли потока жидкости в передаче сигналов в крупных клетках, таких как междоузлия водорослей Characeae. Для понимания свойств передаваемых по клетке фотоиндуцированных сигналов важно сравнить эффекты точечного освещения в условиях непрерывного и временно остановленного потока цитоплазмы. В данной работе по измерениям флуоресценции хлорофилла с помощью метода насыщающих световых импульсов установлено, что локальное освещение клетки в условиях вызванной возбуждением остановки потока цитоплазмы существенно задерживает и замедляет латеральное распространение фотоиндуцированного сигнала, а также приводит к снижению пика максимальной флуоресценции в ответной реакции на прохождение сигнала. Относительная величина такого снижения была небольшой для участков клетки, формирующих на свету наружные щелочные зоны, и существенно возрастала для участков клетки с низким наружным pH. Эти и другие результаты указывают на возможную роль pH цитоплазмы как регулятора флуоресценции и фотосинтетической активности in vivo. В условиях, когда период остановки движения совпадал с воздействием на клетку локального освещения, течение цитоплазмы восстанавливалось медленнее, чем после прерывания потока без дополнительного освещения. Полученные результаты намечают пути дальнейшего изучения регуляторной и защитной функции движения цитоплазмы в фотосинтезирующих клетках растений.
Ключевые слова: Characeae, движение цитоплазмы, потенциал действия, флуоресценция хлорофилла, щелочные и кислые зоны, транспорт протонов.
DOI: 10.7868/S023347551405003X
ВВЕДЕНИЕ
Внутриклеточная подвижность и возбудимость относятся к основным свойствам живых организмов. Непрерывное движение цитоплазмы интегрирует метаболизм разных частей клетки [1], что особенно важно для клеток гигантских размеров, таких как междоузлия харовых водорослей, длина которых может превышать 10 см [2, 3]. Сведения о физиологических проявлениях латерального транспорта, опосредованного потоком цитоплазмы, и о природе транспортируемых сигналов крайне немногочисленны. В ряде работ показана гидродинамическая передача сигналов, вызываемых локальным освещением междоузлий Chara [4—6]. Непрерывный отток компонентов, обмениваемых между неподвижными хлоропла-стами и текущей цитоплазмой в разные моменты
освещения, приводит к пространственному разделению этих метаболитов в потоке.
Установлено, что локальное освещение вызывает последовательные стадии возрастания и снижения флуоресценции в хлоропластах, расположенных ниже по течению цитоплазмы от места приложения фотостимула [7, 8]. Эти сведения указывают на существование двух функционально активных латерально транспортируемых ин-термедиатов. Один из них характеризуется быстрым обменом между освещенными хлоропласта-ми и цитозолем и отвечает за стадию возрастания флуоресценции. Второй агент медленно обменивается через оболочку хлоропластов и вызывает задержанное по времени нефотохимическое тушение флуоресценции. Известно, что освещение индуцирует быстрый обмен Н+ и Са2+ между хло-ропластами и цитоплазмой [9—11] и приводит к
распространению перекиси водорода с потоком цитоплазмы после выхода H2O2 из фотосинтези-рующих пластид [6, 12]. Ионы Н+ и Ca2+ наравне с H2O2 способны осуществлять сигнальные функции в растениях и могут служить посредниками в передаче фотоиндуцированных сигналов по длине клетки. В опытах с внутриклеточной перфузией междоузлий Chara уровень флуоресценции хлорофилла заметно возрастал при повышении pH цитоплазмы (рНц) [7, 8]. В связи с этим представляется вероятным, что усиление флуоресценции при освещении удаленного участка клетки также обусловлено временным повышением pH цитоплазмы, поступающей с потоком из зоны освещения.
Поток жидкости трансформирует динамические изменения уровня метаболитов в окружении неподвижных хлоропластов в пространственно разделенные фракции. В этих условиях лабильные вещества-посредники могут сохраняться за счет их удаления из зоны реакции. Например, кратковременное (~15 с) возрастание рНц в области освещения хлоропластов сменяется его снижением [11, 13], при этом в потоке будут присутствовать раздельные фракции с повышенными и пониженными значениями pH. Сведения о лабильности (динамических изменениях) передаваемых с потоком интермедиатов можно получить путем сравнения изменений флуоресценции, вызываемых локальным освещением клетки в условиях непрерывного и остановленного потока. Известно, что круговое движение цитоплазмы в возбудимых клетках растений останавливается при генерации потенциала действия (ПД) в ответ на химические, механические и электрические стимулы [14]. Однако отсутствуют сведения о том, как сказывается остановка движения цитоплазмы при возбуждении клетки на латеральном переносе сигнальных молекул.
Удобным объектом для изучения латерального транспорта в возбудимых объектах служат интерно-дальные клетки зеленых водорослей Characeae, которые относятся к ближайшим родственникам высших наземных растений. Высокая скорость движения цитоплазмы в этих клетках (до 100 мкм/с) сочетается с электрической возбудимостью плазматических мембран. В отличие от мышечных волокон, сокращающихся при повышении внутриклеточной концентрации Са2+, движение цитоплазмы в растительных клетках временно останавливается при повышении уровня Са2+ в ци-тозоле. Параллельные измерения мембранного потенциала и флуоресценции экворина в клетках Chara показали, что величина [Са2+]ц резко возрастает в момент генерации ПД, а затем постепенно снижается и выходит на исходный уровень за время ~30 с [15]. В течение этого периода цитоплазма остается неподвижной; полное восстановление
скорости течения цитоплазмы занимает до 10 мин. Хотя ингибирующее влияние цитоплазматиче-ского Са2+ на движение цитоплазмы и активность миозина не вызывает сомнений [16, 17], молекулярный механизм такого влияния еще не выяснен. Предполагают, что механизм остановки движения после генерации ПД связан с Са2+-зависи-мым фосфорилированием миозина [18, 19].
Локальное яркое освещение участков клетки, расположенных на расстоянии 1—5 мм вверх по течению цитоплазмы от зоны наблюдения, вызывает появление фотоиндуцированного сигнала в потоке и распространение ответных реакций, выявляемых по изменениям флуоресценции хлоропластов и по сдвигам pH у поверхности клетки [4, 5, 7].
В данной работе ставили цель проследить, как сказывается временная остановка движения цитоплазмы в период локального освещения на изменениях флуоресценции, опосредованных латеральным переносом фотосинтетически активного интермедиата. Основное внимание уделено стадии возрастания флуоресценции, которая проявляется при сравнительно низких интенсив-ностях общей фоновой подсветки. В этих условиях генерация ПД, прерывающая движение цитоплазмы, не оказывает сильного собственного влияния на свечение хлорофилла. Для проверки предполагаемой роли протонов в передаче фото-индуцированных сигналов измерения проводили в зонах выведения и поглощения Н+. Результаты говорят о лабильности фактора, отвечающего за
возрастание флуоресценции при латеральной передаче фотоиндуцированного сигнала. В период действия локального светового импульса уровень физиологически активного метаболита в зоне освещения претерпевает переходное возрастание, сменяемое снижением, что согласуется с представлением об участии фотоиндуцирован-ных сдвигов pH цитоплазмы в регуляции флуоресценции и фотосинтетической активности хло-ропластов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Водоросли Chara corallina выращивали в аквариуме при комнатной температуре на рассеянном дневном свету. Изолированные интернодальные клетки длиной 6—8 см и диаметром около 0.9 мм помещали в искусственную прудовую воду, содержавшую 0.1 мМ KCl, 1.0 мМ NaCl и 0.1 мМ CaCl2. В среду вносили NaHCO3 для доведения pH до 7.0. В ходе опыта клетку укрепляли в прозрачной камере из оргстекла на столике инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 25-CFL (Zeiss, Германия).
Параметры флуоресценции хлорофилла in vivo определяли на микроучастках диаметром ~100 мкм методом насыщающих импульсов, используя
микрофлуориметр Microscopy-PAM (Walz, Германия) с объективом х32/0.4. Данные представлены в виде изменений максимальной флуоресценции
Fm, индуцируемой насыщающими вспышками, и изменений фактической флуоресценции Ft, измеряемой при общем фоновом освещении клетки.
В междоузлиях Chara встречные потоки цитоплазмы проходят по диаметрально противоположным сторонам клетки, которые разделены расстояниями до 900—1000 мкм. Слой цитоплазмы толщиной около 10 мкм включает неподвижную эктоплазму с плотно упакованными рядами хлоропластов, а также примерно равный по толщине слой текущей эндоплазмы. При достаточно высокой численной апертуре объектива глубина резкости не превышает нескольких микрометров. Это позволяет избирательно измерять флуоресценцию хлоропластов, лежащих на нижней стороне клетки, где направление течения цитоплазмы точно определено.
Сигнал с фотоумножителя поступал на блок управления PAM Control Unit и оцифровывался с помощью АЦП PCI-6024E (National Instruments, США) для вывода на компьютер с использованием программы WinWCP (Strathclyde Electrophysio-logy Software).
Фоновое освещение всей клетки создавали с помощью верхнего осветителя микроскопа и светофильтра СЗС-22 (X < 58
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.