ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 1, с. 75-81
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЛЕКТИНЫ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО В УСЛОВИЯХ АБИОТИЧЕСКОГО
СТРЕССА
© 2013 г. А. Н. Левчук, Е. Н. Войтович, В. А. Лях
Запорожский национальный университет, Запорожье, Украина Поступила в редакцию 04.11.2011 г.
На проростках шести сортов льна масличного (Linum humile Mill.) с различной степенью адаптации к абиотическим стрессам (гипо- и гипертермии, осмотическому стрессу и засолению) проанализировали гемагглютинирующую активность и углеводную специфичность лектинов, локализованных в разных частях клетки. В процессе адаптации растений, устойчивых к гипертермии, осмотическому стрессу и засолению, наблюдали значительное увеличение коэффициента активности мембранных лектинов, а при адаптации к гипотермии — лектинов клеточных стенок. У суммарного препарата растворимых лектинов в ходе адаптации растений льна изменялся спектр углеводной специфичности. Так, в процессе адаптации к гипертермии они обнаруживали способность связывать глюкозу и глюко-замин, к осмотическому стрессу - маннозу и ксилозу, к засолению - галактозу, глюкозу и глюкозамин, а при формировании холодоустойчивости у суммарного препарата растворимых лектинов обнаруживалась способность распознавать лактозу и фруктозу. Высказано предположение, что лекти-ны могут служить компонентами специфической адаптации растений льна к абиотическим стрессовым факторам различной природы.
Ключевые слова: Ьтыт НытПв — адаптация - абиотический стресс — гипо- и гипертермия — осмотический стресс — засоление — спектр углеводной специфичности — лектины
Б01: 10.7868/80015330312060103
ВВЕДЕНИЕ
Из-за отсутствия мобильности растительные организмы не способны избегать негативного влияния факторов окружающей среды, поэтому вынуждены приспосабливаться к новым условиям окружающей среды, меняя при этом свой метаболизм [1, 2].
Не последнюю роль в формировании устойчивости у растений играют лектины — гликопротеи-ны, способные распознавать и связывать углеводы, расположенные на клеточных поверхностях [3]. Характеризуют лектины по двум признакам: количественному (по лектиновой активности — минимальной концентрации белка, которая проявляет биологическую активность) и качественному (по углеводной специфичности — способности распознавать определенные углеводы) [4, 5]. По локализации в клетке лектины разделяют на три группы: мембранные (расположенные в цитоплазмати-ческой мембране и мембранах органелл), раство-
Сокращение: ЛА - лектиновая активность. Адрес для корреспонденции: Левчук Анна Николаевна. Украина, 69041 Запорожье, ул. Жуковского, 66. Запорожский национальный университет. Электронная почта: anna.levchuck@yandex.ru
римые (находящиеся в цитозоле и вакуолярном соке) и лектины клеточных стенок [4, 6].
На различных культурах показана роль лектинов разных клеточных фракций в адаптации к абиотическим стрессовым факторам [7]. Так, лектины клеточных стенок и мембран органелл участвуют в формировании устойчивости к низким температурам [8, 9], а растворимые и мембранные лектины - к засолению [10-14].
Целью работы было выявление изменений в характеристиках лектинов льна масличного в зависимости от общего уровня неспецифической устойчивости на ранних этапах онтогенеза и степени адаптации растения к абиотическим стрессовым факторам: гипо- и гипертермии, осмотическому стрессу и натрий-хлоридному засолению на фоне осмотического стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работу проводили с 7-дневными этиолированными проростками льна масличного (Linum humile Mill.) шести генотипов (сорта Циан, Антарес, Айсберг, Авангард, Астрал и Золотистый), различающихся по степени адаптации к выбранным абиотическим стрессовым факторам [15]. Семена
предварительно проращивали в течение 5 суток в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой при комнатной температуре (22°С) в темноте.
Для создания гипо- и гипертермии 5-дневные проростки выдерживали в течение суток при 4 и 40°С соответственно. Для моделирования осмотического стресса в среду вносили сахарозу до концентрации 15% (1.13 МПа) или хлорид натрия до концентрации 3% (2.24 МПа) В последнем случае на фоне осмотического стресса сказывалось еще и токсическое действие солей (засоление). В этих растворах проростки инкубировали в течение 24 ч.
Лектины экстрагировали без учета органной принадлежности на стадии 7-дневных проростков после 24-часового стрессового воздействия и последующего 24-часового периода адаптации.
Экстракты лектинов характеризовали по двум параметрам: количественному (лектиновой активности) и качественному (углеводной специфичности).
Лектины экстрагировали из разных клеточных фракций (мембран, растворимой части цитоплазмы и клеточных стенок) по стандартным методикам [9, 16] с некоторыми модификациями: клеточные фракции разделяли методом фракционного центрифугирования, лектины извлекали 0.02 М калий-фосфатным буферным раствором с рН 6.8 с добавлением 0.35 М сахарозы, 0.1 М аскорбиновой кислоты и 0.01 М Трилона Б.
Навеску проростков (0.5 г) гомогенизировали с 8 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6.8). Для отделения клеточных стенок отжимали полученную суспензию через два слоя льняной ткани. Осадок клеточных стенок (остаток на льняной ткани после отжима) гомогенизировали с 5 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 4.0) с добавлением детергента Тритон Х-100 до уровня 0.05% и оставляли для экстракции на 12 ч при температуре 4°С, после чего центрифугировали 15 мин при 10000 g.
Супернатант (фракцию, обогащенную лекти-нами клеточных стенок) использовали для дальнейшего анализа. Для извлечения органелл оставшуюся после отделения клеточных стенок суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин: осадок содержал ядра, митохондрии, пластиды, а супернантант — преимущественно цитозоль и вакуолярный сок. Для извлечения мембран из полученного осадка органелл его гомогенизировали с 0.5 мл исходного калий-фосфатного буфера (рН 6.8) с добавлением Тритона Х-100 до концентрации 0.05% и оставляли для экстракции на 20 мин. Полученную суспензию центрифугировали в том же режиме, при этом на-досадочная фракция содержала мембранные лек-тины. Из полученных растворов лектины всех
фракций концентрировали путем высаливания 70% сульфатом аммония, а осадок разводили в 0.4 мл 0.9% раствора хлорида натрия. Полученный раствор лектинов дополнительно очищали путем осаждения при 60% насыщении ацетона (2 части ацетона на 1 часть раствора лектина). Лектины являются устойчивыми к такой высокой концентрации ацетона, и при растворении осадка в физиологическом растворе восстанавливают свою исходную структуру. Остальные белки при такой концентрации окончательно денатурируются [4].
Активность лектинов определяли с помощью реакции гемагглютинации с 2% суспензией эритроцитов кролика [4]. Концентрацию белка определяли спекрофотометрически по методу Варбурга-Кристиана [17]. Лектиновую активность (ЛА) выражали как коэффициент 1/ЛА в (мкг/мл)-1. Углеводную специфичность определяли с помощью реакции угнетения гемагглютинации отдельными углеводами [4]. Исследования проводили в 5-кратной повторности, результаты обрабатывали с помощью стандартных статистических методов [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ранее нами было обнаружено, что проростки разных генотипов льна масличного различаются по степени адаптации к ряду абиотических стрессовых факторов. Так, было выявлено, что способностью адаптироваться к пониженной температуре отличились сорта Антарес, Циан и Айсберг, к повышенной — Айсберг, Астрал и Золотистый, а к засолению —Циан и Золотистый. Вместе с тем, высокая степень адаптации к осмотическому стрессу оказалась характерной для всех исследованных сортов, за исключением сорта Авангард [15].
Мы установили, что в ответ на воздействие абиотических стрессов существенно изменялся коэффициент лектиновой активности проростков (1/ЛА), при этом прослеживалась зависимость этих изменений от типа стрессового воздействия, локализации лектинов в клетке и уровня устойчивости генотипа к определенному фактору.
В процессе адаптации проростков к пониженной температуре клеточных стенок холодостойких генотипов (сорта Антарес, Циан и Айсберг) величина 1/ЛА значительно повышалась: от 300 раз у проростков сорта Антарес до 1000 раз у проростков сортов Айсберг и Циан (рис. 1). При этом у проростков неустойчивых генотипов — Авангард, Астрал и Золотистый — коэффициент ЛА существенно снижался. Так, у проростков льна сортов Авангард и Золотистый 1/ЛА снижался в 5 раз, а у сорта Астрал — в 30 раз от контрольного значения (рис. 1). При действии других стрессовых факторов (гипертермии, осмотического стресса и осмотического стресса на фоне
св Н Я о
Я Я
-е -е
т о М о Я Я
о ^
Я
ч о
10000
1000
» 100 л
т св
л 10 <
ЛА 1
0.1 0.01
" 3
I
Антарес Авангард Циан Айсберг Астрал Золотистый
Рис. 1. Изменение активности суммарных препаратов лектинов различной клеточной локализации в проростках льна масличного при действии пониженной температуры.
1 — мембранные лектины, 2 — растворимые лектины, 3 — лектины клеточных стенок.
а т н е и Я и
-е -е
т
о
М
е и н е
^
и
л е
в Ув
100
ы
т
а р
< Л
10
0.1
0.01
[Г
I
Антарес Авангард Циан Айсберг Астрал Золотистый
Рис. 2. Изменение активности суммарных препаратов лектинов различной клеточной локализации в проростках льна масличного при действии повышенной температуры.
1 — мембранные лектины, 2 — растворимые лектины, 3 — лектины клеточных стенок.
2
1
3
1
засоления) зависимости изменения коэффициента ЛА от уровня устойчивости обнаружено не было. При воздействии повышенной температуры коэффициент ЛА у проростков сортов Золотистый, Циан и Авангард увеличивался, а у проростков остальных генотипов — уменьшался. В то же время, устойчивыми к этому стрессу оказались сорта Астрал, Айсберг и Золотистый (рис. 2). При действии осмотического стресса и засоления коэффициент ЛА клеточных стенок возрастал у проростков всех исследованных генотипов вне зависимости от уровня устойчивости (рис. 3 и 4 соответственно).
При адаптации ко всем исследованным абиотическим стресс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.