УДК 577.24
ЛЕПТИН ЧЕЛОВЕКА СТИМУЛИРУЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ A549 ПУТЕМ БЛОКИРОВАНИЯ АПОПТОЗА, ИНИЦИИРОВАННОГО СТРЕССОМ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА*
© 2013 г. Вей Ванг1#, Хейченг Йен#, Ченгву Ду2**, Йол Cу2
1 Respiratory Medicine, Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, Guangzhou, 510120, China
2 Neurosurgery, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, huhehaote, 010051, China;fax: +86(0471)663-7640, E-mail: changwudou@126.com
Поступила в редакцию 04.05.13 После доработки 13.09.13
Рак легких — заболевание, характеризующееся бесконтрольным ростом клеток в тканях легкого. Лепнин — это прейотропный гормон, обладающий антиапоптотическим и пропролиферативным действием и принимающий участие в некоторых регуляторных путях. Однако, пока мало что известно о механизме его анти-апоптотического действия при немелкоклеточном раке легкого (NSCLC). Это и послужило предметом нашего исследования. Мы изучали пролиферацию, апоптоз и специфику механизма действия лептина в раковых и в трансфецированных клетках, экспрессирующих повышенные количества лептина. Для определения лептина, фосфо-PERK (p-Perk), IRE1, расщепленной формы ATF6, сплесненной формы XBP1, eIF2-a, TRAF2, CHOP и каспазы 12 — использовали метод иммуноблоттинга. Для определения специфических мРНК, появляющихся в результате стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР), использовали метод полуколичественной ПЦР в режиме реального времени. Установлено, что в клетках аденокарциномы легких человека линии A549 и в трансфецированных клетках лептин мог ингибировать транскрипцию специфических мРНК, а также экспрессию соответствующих им белков, появляющихся при индуцированном цис-платином стрессе ЭР Показано, что протеинкиназа PERK и активирующий фактор транскрипции ATF6, вовлеченные в UPR (реакция на частично денатурированные белки) стресса ЭР, участвуют в процессе воздействия лептина на апоптоз. Установлено также, что уровни экспрессии фактора транскрипции XBP1 и фактора TRAF2 в клетках, практически не экспрессирующих лептин (A549-siLPT и нетрансфецированные клетки BEAS2B), существенно увеличивались под воздействием цисплатина. Экспрессия проатоптотичес-кого фактора транскрипции CHOP блокировалась в клетках, экспрессирующих лептин (клетки A549 и трансфецированные клетки BEAS2B групп LPT-PeP и LPT-EX). Мы предположили, что лептин мог инициировать пролиферацию клеток путем блокирования апоптоза, индуцированного стрессом ЭР. Это блокирование осуществлялось при посредстве р-Perk и ATF6 путем ингибирования экспрессии CHOP.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: апоптоз, стресс эндоплазматического ретикулума, лептин, TRAF2, XPB1.
Известно, что при отсутствии соответствующего лечения опухоль легких активно метастази-рует в различные ткани и органы всего организма. По своим гистологическим характеристикам различные формы злокачественных опухолей подразделяются на аденокарциномы, чашуйчатокле-точные карциномы и крупноклеточный рак легких [1]. Из всех случаев рака легких >80% приходится на немелкоклеточный рак (№СЬС) [2]. Подавляющее большинство злокачественных новообразований, возникающих изначально в легоч-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-135, 01.09.2013.
** Адресат для корреспонденции.
# Вклад этих авторов в работу одинаков.
ной ткани и классифицируемых как первичный рак легких, относятся к карциномам и происходят из эпителиальных клеток. В настоящее время необходимы новые методы терапии, способные снизить все возрастающий процент заболеваемости людей раком легких [3]. В связи с этим, исследование клеток-мишеней для трансформации и изучение механизма развития №СЬС все в большей степени становятся одним из горячих направлений в разработке терапии рака легких.
Описаны три главных пути апоптоза: 1) путь, опосредуемый митохондриями, 2) эндоплазма-тическим ретикулумом (ЭР) и 3) опосредуемый рецепторами [4]. Многими исследованиями было продемонстрировано, что стресс ЭР играет критическую роль в регуляции апоптоза [5, 6] и может служить пусковым механизмом для неко-
1684
торых специфических сигнальных путей, приводящих к апоптозу, например, ЭР-ассоцииро-ванная деградация белков (ERAD) и реакция на развернутые (частично денатурированные) белки (UPR) [7]. В реакцию UPR вовлечены: белок 1, требовательный к инозитолу (IRE1), PKR-по-добная протеинкиназа ER (PERK) и активирующий фактор транскрипции 6 (ATF6) [8, 9]. Активированная PERK фосфорилирует эукариотичес-кий фактор инициации трансляции 2а (eIF-2a), что приводит к супрессии биосинтеза белков. Активация РНК гидролазной активности белков IRE1 приводит к инициации сплайсинга мРНК, кодирующей Х-бокс фактор транскрипции 1 (XBP-1 мРНК), что впоследствии приводит к синтезу мощного фактора транскрипции (сплесненный XBP-1). Совместно с фактором ATF6 сплесненная форма фактора XBP-1 оказывают положительное регуляторное воздействие на экспрессию многочисленных генов-мишеней UPR, таких как резидентные шапероны эндо-плазматического ретикулума. Белок CHOP является проапоптотическим фактором транскрипции, который выступает в качестве супрессора транскрипции гена BCL2 (В-клеточная лимфо-ма 2). Продукт этого гена (белок Bcl-2) может быть индуцирован путем совместного воздействия PERK/ATF4 и фактора ATF6 [9].
Лептин — это белковый гормон, имеющий Mr 16 кДа, который играет решающую роль в регулировании поглощения и расходования энергии, включая регуляцию аппетита и чувства голода, регуляцию метаболизма и пищевого поведения. Кроме того, он оказывает пропролифера-тивное и антиапоптотическое действие в клетках некоторых злокачественных опухолей, образующихся при раке легких, желудка и молочных желез [10—12]. Рецепторы к лептину присутствуют в нормальной ткани легких человека. Однако ни антиапоптотическое действие, ни механизм функционирования лептина в клетках злокачественных опухолей легких остаются неизвестными. В представленной работе исследован механизм антиатоптотического воздействия лептина в клетках злокачественных опухолей легких, особенно при немелкоклеточном раке (NSCLC).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культура клеток и трансфекция. Клетки аде-нокарциномы легких человека линии A549 и нетрансформированные клетки эпителия бронхов человека линии BEAS2B были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC). Клетки культивировали в полной среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную фетальную
сыворотку крупного рогатого скота, 200 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37° в атмосфере 5%-ной СО2. За 24 ч до транс-фекции клетки BEAS2B раскапывали в 6- или 96-луночные микропланшеты («Falcon», Япония). Различные количества рекомбинантных плаз-мид наносили на монослой клеток BEAS2B и проводили трансфекцию с использованием реагента Lipofectamine™ 2000 («Invitrogen», США). Клетки собирали в буфер PBS с помощью трип-син/ЭДТА, центрифугировали и суспендировали в буфере для лизиса в соответствии с процедурой, описанной в работе Ванг и соавт. [13].
Конструирование плазмиды. Ген лептина человека был амплифицирован из кДНК адипо-цитов, полученных из подкожного жира пациентов. Для амплификации были использованы следующие праймеры:
Прямой: 5'-GGATCCATGGTTCCAATCCAA-AAAGTCCAAGAGG-3' (подчеркнут сайт BamH I);
обратный: 5'-GCGGCCGCCTCAGCACCC-AGGGCTGAGG-3' (подчеркнут сайт Not I).
ПЦР проводили в следующих условиях: при 94° 1,5 мин, далее при 94° 30 с, при 63° 30 с и при 72° 30 с, в общей сложности 30 циклов, и финальное удлинение при 72° в течение 10 мин. Продукт ПЦР был лигирован в вектор экспрессии pcDNA3.1(+); результирующая рекомбинант-ная плазмида pcDNA3.1-LPT могла экспресси-ровать лептин человека.
Обработка клеток лептиновым пептидом. Леп-тиновый пептид человека (Asn-Val-Ile-Gln-Ile-Ser-Asn-Asp-Leu-Glu-Asn-Leu-Arg, LPT-PeP) («ChemicalBook», США) в концентрации 100 нМ добавляли к клеткам BEAS2B за 4 ч до их инкубации в присутствии или в отсутствие цисплати-на. Позднее из клеток получали лизаты и определяли в них белки, ассоциированные со стрессом ЭР, методом Вестерн-блоттинга.
Транфекция интерферирующей siРНК. В экспериментах по интерференции была использована короткая двуцепочечная siPHK против лептина (siLPT) (фирма «Invitrogen», США). Кратковременную трансфекцию siLPT в клетки A549 проводили с использованием трансфецирующего реагента Lipofectamine 2000 в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Клетки A549 высевали в 6-луночные планшеты (для дальнейшего анализа РНК или белка) или в 96-лу-ночные планшеты (для анализа фрагментации ДНК или клеточной пролиферации). Через 24 ч культивирования ростовую среду заменяли на бессывороточную среду RPMI 1640, содержащую 100 нМ siLPT и трансфецирующий реагент. Клетки для тестирования собирали ежедневно в течение последующих 3 дней после трансфекции двуспиральной РНК.
Экспериментальные группы клеток. В соответствии с изложенными выше экспериментальными подходами было сформировано пять экспериментальных групп клеток: 1) A549 — адено-карцинома легких линии A549; 2) A549-siLPT — клетки A549, трансфецированные интерферирующей siPHK; 3) нетрансфецированные нормальные клетки BEAS2B; 4) LPT-PeP — клетки BEAS2B, обработанные (трансфецированные) лептиновым пептидом человека; 5) LPT-EX — клетки BEAS2B, трансфецированные рекомби-нантной плазмидой pcDNA3.1-LPT.
Вестерн-блоттинг. Белки клеточных лизатов разделяли методом Ds-Na-электрофореза в 15%-ном ПААГ и переносили на нитроцеллю-лозные мембраны. Мембраны блокировали буфером PBST, содержащем 5%-ное обезжиренное молоко, в течение ночи при 4°, а затем инкубировали с соответствующими специфическими антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. В качестве специфических антител были использованы: моноклональные (mAb) против лептина (1 : 2000) («Santa Cruz», США), mAb против человеческого IRE1 (1 : 3000), mAb против человеческой p-Perk (1 : 2000), козьи поликлональ-ные (pAb) против человеческого CHOP (1 : 1000), кроличьи pAb против человеческой каспазы 12 (1 : 1000) («Santa Cruz», США), mAb против полноразмерного и сплесненного XBP1 (1 : 1000) («Stressgen»,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.