научная статья по теме ЛЕПТИН ЧЕЛОВЕКА СТИМУЛИРУЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ A549 ПУТЕМ БЛОКИРОВАНИЯ АПОПТОЗА, ИНИЦИИРОВАННОГО СТРЕССОМ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА Химия

Текст научной статьи на тему «ЛЕПТИН ЧЕЛОВЕКА СТИМУЛИРУЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ A549 ПУТЕМ БЛОКИРОВАНИЯ АПОПТОЗА, ИНИЦИИРОВАННОГО СТРЕССОМ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА»

УДК 577.24

ЛЕПТИН ЧЕЛОВЕКА СТИМУЛИРУЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ A549 ПУТЕМ БЛОКИРОВАНИЯ АПОПТОЗА, ИНИЦИИРОВАННОГО СТРЕССОМ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА*

© 2013 г. Вей Ванг1#, Хейченг Йен#, Ченгву Ду2**, Йол Cу2

1 Respiratory Medicine, Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, Guangzhou, 510120, China

2 Neurosurgery, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, huhehaote, 010051, China;fax: +86(0471)663-7640, E-mail: changwudou@126.com

Поступила в редакцию 04.05.13 После доработки 13.09.13

Рак легких — заболевание, характеризующееся бесконтрольным ростом клеток в тканях легкого. Лепнин — это прейотропный гормон, обладающий антиапоптотическим и пропролиферативным действием и принимающий участие в некоторых регуляторных путях. Однако, пока мало что известно о механизме его анти-апоптотического действия при немелкоклеточном раке легкого (NSCLC). Это и послужило предметом нашего исследования. Мы изучали пролиферацию, апоптоз и специфику механизма действия лептина в раковых и в трансфецированных клетках, экспрессирующих повышенные количества лептина. Для определения лептина, фосфо-PERK (p-Perk), IRE1, расщепленной формы ATF6, сплесненной формы XBP1, eIF2-a, TRAF2, CHOP и каспазы 12 — использовали метод иммуноблоттинга. Для определения специфических мРНК, появляющихся в результате стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР), использовали метод полуколичественной ПЦР в режиме реального времени. Установлено, что в клетках аденокарциномы легких человека линии A549 и в трансфецированных клетках лептин мог ингибировать транскрипцию специфических мРНК, а также экспрессию соответствующих им белков, появляющихся при индуцированном цис-платином стрессе ЭР Показано, что протеинкиназа PERK и активирующий фактор транскрипции ATF6, вовлеченные в UPR (реакция на частично денатурированные белки) стресса ЭР, участвуют в процессе воздействия лептина на апоптоз. Установлено также, что уровни экспрессии фактора транскрипции XBP1 и фактора TRAF2 в клетках, практически не экспрессирующих лептин (A549-siLPT и нетрансфецированные клетки BEAS2B), существенно увеличивались под воздействием цисплатина. Экспрессия проатоптотичес-кого фактора транскрипции CHOP блокировалась в клетках, экспрессирующих лептин (клетки A549 и трансфецированные клетки BEAS2B групп LPT-PeP и LPT-EX). Мы предположили, что лептин мог инициировать пролиферацию клеток путем блокирования апоптоза, индуцированного стрессом ЭР. Это блокирование осуществлялось при посредстве р-Perk и ATF6 путем ингибирования экспрессии CHOP.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: апоптоз, стресс эндоплазматического ретикулума, лептин, TRAF2, XPB1.

Известно, что при отсутствии соответствующего лечения опухоль легких активно метастази-рует в различные ткани и органы всего организма. По своим гистологическим характеристикам различные формы злокачественных опухолей подразделяются на аденокарциномы, чашуйчатокле-точные карциномы и крупноклеточный рак легких [1]. Из всех случаев рака легких >80% приходится на немелкоклеточный рак (№СЬС) [2]. Подавляющее большинство злокачественных новообразований, возникающих изначально в легоч-

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-135, 01.09.2013.

** Адресат для корреспонденции.

# Вклад этих авторов в работу одинаков.

ной ткани и классифицируемых как первичный рак легких, относятся к карциномам и происходят из эпителиальных клеток. В настоящее время необходимы новые методы терапии, способные снизить все возрастающий процент заболеваемости людей раком легких [3]. В связи с этим, исследование клеток-мишеней для трансформации и изучение механизма развития №СЬС все в большей степени становятся одним из горячих направлений в разработке терапии рака легких.

Описаны три главных пути апоптоза: 1) путь, опосредуемый митохондриями, 2) эндоплазма-тическим ретикулумом (ЭР) и 3) опосредуемый рецепторами [4]. Многими исследованиями было продемонстрировано, что стресс ЭР играет критическую роль в регуляции апоптоза [5, 6] и может служить пусковым механизмом для неко-

1684

торых специфических сигнальных путей, приводящих к апоптозу, например, ЭР-ассоцииро-ванная деградация белков (ERAD) и реакция на развернутые (частично денатурированные) белки (UPR) [7]. В реакцию UPR вовлечены: белок 1, требовательный к инозитолу (IRE1), PKR-по-добная протеинкиназа ER (PERK) и активирующий фактор транскрипции 6 (ATF6) [8, 9]. Активированная PERK фосфорилирует эукариотичес-кий фактор инициации трансляции 2а (eIF-2a), что приводит к супрессии биосинтеза белков. Активация РНК гидролазной активности белков IRE1 приводит к инициации сплайсинга мРНК, кодирующей Х-бокс фактор транскрипции 1 (XBP-1 мРНК), что впоследствии приводит к синтезу мощного фактора транскрипции (сплесненный XBP-1). Совместно с фактором ATF6 сплесненная форма фактора XBP-1 оказывают положительное регуляторное воздействие на экспрессию многочисленных генов-мишеней UPR, таких как резидентные шапероны эндо-плазматического ретикулума. Белок CHOP является проапоптотическим фактором транскрипции, который выступает в качестве супрессора транскрипции гена BCL2 (В-клеточная лимфо-ма 2). Продукт этого гена (белок Bcl-2) может быть индуцирован путем совместного воздействия PERK/ATF4 и фактора ATF6 [9].

Лептин — это белковый гормон, имеющий Mr 16 кДа, который играет решающую роль в регулировании поглощения и расходования энергии, включая регуляцию аппетита и чувства голода, регуляцию метаболизма и пищевого поведения. Кроме того, он оказывает пропролифера-тивное и антиапоптотическое действие в клетках некоторых злокачественных опухолей, образующихся при раке легких, желудка и молочных желез [10—12]. Рецепторы к лептину присутствуют в нормальной ткани легких человека. Однако ни антиапоптотическое действие, ни механизм функционирования лептина в клетках злокачественных опухолей легких остаются неизвестными. В представленной работе исследован механизм антиатоптотического воздействия лептина в клетках злокачественных опухолей легких, особенно при немелкоклеточном раке (NSCLC).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культура клеток и трансфекция. Клетки аде-нокарциномы легких человека линии A549 и нетрансформированные клетки эпителия бронхов человека линии BEAS2B были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC). Клетки культивировали в полной среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную фетальную

сыворотку крупного рогатого скота, 200 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37° в атмосфере 5%-ной СО2. За 24 ч до транс-фекции клетки BEAS2B раскапывали в 6- или 96-луночные микропланшеты («Falcon», Япония). Различные количества рекомбинантных плаз-мид наносили на монослой клеток BEAS2B и проводили трансфекцию с использованием реагента Lipofectamine™ 2000 («Invitrogen», США). Клетки собирали в буфер PBS с помощью трип-син/ЭДТА, центрифугировали и суспендировали в буфере для лизиса в соответствии с процедурой, описанной в работе Ванг и соавт. [13].

Конструирование плазмиды. Ген лептина человека был амплифицирован из кДНК адипо-цитов, полученных из подкожного жира пациентов. Для амплификации были использованы следующие праймеры:

Прямой: 5'-GGATCCATGGTTCCAATCCAA-AAAGTCCAAGAGG-3' (подчеркнут сайт BamH I);

обратный: 5'-GCGGCCGCCTCAGCACCC-AGGGCTGAGG-3' (подчеркнут сайт Not I).

ПЦР проводили в следующих условиях: при 94° 1,5 мин, далее при 94° 30 с, при 63° 30 с и при 72° 30 с, в общей сложности 30 циклов, и финальное удлинение при 72° в течение 10 мин. Продукт ПЦР был лигирован в вектор экспрессии pcDNA3.1(+); результирующая рекомбинант-ная плазмида pcDNA3.1-LPT могла экспресси-ровать лептин человека.

Обработка клеток лептиновым пептидом. Леп-тиновый пептид человека (Asn-Val-Ile-Gln-Ile-Ser-Asn-Asp-Leu-Glu-Asn-Leu-Arg, LPT-PeP) («ChemicalBook», США) в концентрации 100 нМ добавляли к клеткам BEAS2B за 4 ч до их инкубации в присутствии или в отсутствие цисплати-на. Позднее из клеток получали лизаты и определяли в них белки, ассоциированные со стрессом ЭР, методом Вестерн-блоттинга.

Транфекция интерферирующей siРНК. В экспериментах по интерференции была использована короткая двуцепочечная siPHK против лептина (siLPT) (фирма «Invitrogen», США). Кратковременную трансфекцию siLPT в клетки A549 проводили с использованием трансфецирующего реагента Lipofectamine 2000 в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Клетки A549 высевали в 6-луночные планшеты (для дальнейшего анализа РНК или белка) или в 96-лу-ночные планшеты (для анализа фрагментации ДНК или клеточной пролиферации). Через 24 ч культивирования ростовую среду заменяли на бессывороточную среду RPMI 1640, содержащую 100 нМ siLPT и трансфецирующий реагент. Клетки для тестирования собирали ежедневно в течение последующих 3 дней после трансфекции двуспиральной РНК.

Экспериментальные группы клеток. В соответствии с изложенными выше экспериментальными подходами было сформировано пять экспериментальных групп клеток: 1) A549 — адено-карцинома легких линии A549; 2) A549-siLPT — клетки A549, трансфецированные интерферирующей siPHK; 3) нетрансфецированные нормальные клетки BEAS2B; 4) LPT-PeP — клетки BEAS2B, обработанные (трансфецированные) лептиновым пептидом человека; 5) LPT-EX — клетки BEAS2B, трансфецированные рекомби-нантной плазмидой pcDNA3.1-LPT.

Вестерн-блоттинг. Белки клеточных лизатов разделяли методом Ds-Na-электрофореза в 15%-ном ПААГ и переносили на нитроцеллю-лозные мембраны. Мембраны блокировали буфером PBST, содержащем 5%-ное обезжиренное молоко, в течение ночи при 4°, а затем инкубировали с соответствующими специфическими антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. В качестве специфических антител были использованы: моноклональные (mAb) против лептина (1 : 2000) («Santa Cruz», США), mAb против человеческого IRE1 (1 : 3000), mAb против человеческой p-Perk (1 : 2000), козьи поликлональ-ные (pAb) против человеческого CHOP (1 : 1000), кроличьи pAb против человеческой каспазы 12 (1 : 1000) («Santa Cruz», США), mAb против полноразмерного и сплесненного XBP1 (1 : 1000) («Stressgen»,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком