ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 453, № 4, с. 457-460
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.115.3:512.112.064
ЛЕЙЦИНСОДЕРЖАЩИЕ ГЛИПРОЛИНЫ (PRO -GLY-PRO - LEU И LEU-PRO-GLY-PRO): УЧАСТИЕ В РЕАКЦИЯХ ГЕМОСТАЗА IN VITRO И IN VIVO В УСЛОВИЯХ НАРУШЕНИЙ ПРОЦЕССОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ И ЖИРОВОГО ОБМЕНА У КРЫС
© 2013 г. Академик Н. Ф. Мясоедов, Д. Л. Рочев, Л. А. Ляпина, Т. Ю. Оберган, Л. А. Андреева
Поступило 24.05.2013 г.
DOI: 10.7868/S0869565213340252
Короткие пептиды глипролинового ряда, аминокислотные последовательности которых состоят только из остатков глицина и пролина, образуются в организме в результате внутри- и экстраклеточного катаболизма коллагена, эластина и родственных белков, а также в процессе протео-литического расщепления белков, поступающих с пищей [1]. В настоящее время также получены различные синтетические аналоги этих природных пептидов. Глипролины влияют на некоторые системы организма, в том числе на систему свертывания крови [2].
Создан целый ряд пептидов путем включения в структуру молекулы глипролинов тех или иных аминокислот, например аргинина, который повышает уровень NO в крови и приводит к проти-восвертывающему эффекту. Такие пептиды, как правило, обладают высокой устойчивостью к протеазам и сохраняют активности предшественников [3]. Созданы глипролины с включением аргинина, который повышает уровень NO в крови и приводит к противосвертывающему эффекту. Известно, что другая аминокислота — лейцин необходима для поддержания нормального уровня холестерина в плазме крови [4].
Целью данной работы являлось изучение эффектов двух тетрапептидов глипролинового ряда, включающих аминокислоту лейцин с N- (Leu-Pro-Gly-Pro) или С-конца (Pro-Gly-Pro-Leu), на параметры гемостаза в условиях in vitro и на состояние свертывающей, противосвертывающей систем организма, а также на жировой обмен при гиперхолестеринемии у крыс.
Институт молекулярной генетики Российской Академии наук, Москва Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе применяли пептиды Pro-Gly-Pro-Leu (PGPL) и Leu-Pro-Gly-Pro (LPGP), синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН, а также лейцин (Leu) отечественного производства; коммерческие препараты фибриногена и тромбина (Литва).
В условиях in vitro к нормальной плазме крови добавляли различные концентрации каждого из пептидов, инкубировали при 37°С не менее 5 мин и далее производили анализ следующих параметров гемостаза: активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (диагностический набор "АЧТВ-тест", ООО "Технология-Стандарт", Россия); агрегацию тромбоцитов с использованием препарата АДФ фирмы "Appli-Chem GmbH" (Германия). Дополнительно осуществляли определение фибриндеполимериза-ционной активности (ФДПА) каждого из пептидов и их составной части — лейцина [5].
В первой части экспериментов здоровым животным (крысам) интраназально в течение трех суток вводили пептид PGPL в дозе 1 мг на 1 кг массы тела. Изучали антикоагулянтно-фибрино-литические свойства плазмы крови через 1 ч после последнего введения пептида.
Во второй части экспериментов in vivo использовали две модели животных — тромбообразова-ния (метод Wessler) c нашей модификацией и ги-перхолестеринемии [6, 7].
В первой серии этих экспериментов исследовали антитромботические эффекты PGPL и Leu на модели тромбообразования на 75 лабораторных белых крысах-самцах с массой тела 200—250 г. Животным в течение трех дней интраназально вводили пептид в дозе 1 мг/кг массы тела (1-я группа), Leu (2-я группа) в дозе, эквивалентной его содержанию в пептиде (0.33 мг/кг), и 0.85%-й раствор NaCl (3-я группа, контроль). Антитром-
458 МЯСОЕДОВ и др.
Таблица 1. Параметры системы гемостаза (%) при действии пептидов PGPL и LPGP в условиях in vitro (моль/л)
Параметры гемостаза LPGP PGPL NaCl
10— -4 10—6 10— 8 10— 4 10—6 10— 8
ТВ 134 ± 9** 127 ± 3** 150 ± 14** 116 ± 3* 112 ± 4* 120 ± 6* 100 ± 5
АЧТВ 115 ± 5* 107 ± 2* 105 ± 2 116.5 ± 3** 111.5 ± 2** 108 ± 2* 100 ± 1
СФА 184 ± 6** 165 ± 7** 159 ± 6** 361 ± 22** 314± 32** 231 ± 23** 100 ± 5
НФ 170 ± 6** 183 ± 5** 165.2 ± 4** 382 ± 22** 294 ± 25** 171.4 ± 20* 100 ± 7
Примечание. Здесь и в табл. 2, 3 статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля; сравнение опыта с контролем: *р < 0.05, **р < 0.01; обозначения параметров гемостаза в тексте.
ботический эффект исследуемых препаратов оценивали по весу сгустков через 1 ч после их последнего введения.
Во второй серии работы (модель гиперхолесте-ринемии) было использовано 40 лабораторных белых крыс-самцов с массой тела 350—450 г. Выявляли лечебное действие исследуемых пептидов на параметры гемостаза и липидный обмен после трехмесячного содержания животных на жировой диете. Далее ежедневно через каждые 24 ч на протяжении 9 сут крысам вводили исследуемые пептиды интраназально в дозе 1 мг/кг массы тела, а контрольной группе в те же сроки 0.85%-й раствор NaCl.
Через 1 ч после последнего введения пептида (опыт) или физиологического раствора (контроль) и через 7 сут после их отмены при продолжающемся содержании животных на жировом рационе у них натощак брали кровь на анализы из v. jugularis в количестве 2 мл с использованием в качестве консерванта 3.8%-го раствора цитрата натрия в соотношении кровь : консервант 9 : 1. Образцы крови центрифугировали при 3000g в течение 10—12 мин для получения бедной тромбоцитами плазмы.
Для оценки состояния гемостаза определяли АЧТВ [8], тромбиновое время (ТВ), суммарную (СФА) и неферментативную (НФ) фибринолити-ческую активность на пластинах нестабилизиро-ванного фибрина [5], активность тканевого активатора плазминогена (ААП) на стандартных фиб-риновых пластинах общепринятым методом, агрегацию тромбоцитов (АТ) по методу Born [8] на приборе "Агрегометр" (Россия), используя в качестве индуктора агрегации АДФ в конечной концентрации 15 мкМ.
Показатели жирового обмена в плазме крови исследовали энзиматическим колориметрическим методом с использованием набора реагентов фирмы "Ольвекс-Диагностикум" (Россия). При этом определяли концентрацию общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ) и холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП). Результаты выражали в ммоль/л.
Все данные были обработаны статистически по непараметрическому критерию Вилкоксона— Манна—Уитни и методу Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что исследуемые пептиды PGPL и LPGP обладали умеренной антикоагулянтной активностью. При концентрациях от 10-8 до 10-4 М наблюдалось достоверное удлинение АЧТВ у обоих исследуемых пептидов на 5—17%, ТВ — на 12— 20% под действием PGPL и на 27—50% под влиянием LPGP, повышение СФА на 50-250%, ФДПА на 70-280% по сравнению с контролем. PGPL обладал ФДПА в большей степени, чем LPGP (табл. 1). Следовательно, исследуемым пептидам присуще антикоагулянтное и неферментативное фибри-нолитическое действие, отмечаемое нами в условиях in vitro.
В первой части экспериментов in vivo исследовали PGPL через 1 ч после его последнего введения здоровым животным. При этом отмечено повышение антикоагулянтного фона плазмы животных по тесту АЧТВ на 18%, а также достоверное возрастание показателей фибринолитической системы плазмы животных: СФА—на 45.2 %, НФ -на 39.1%, активность ААП — на 64.4%. Таким образом, пептид PGPL при его многократном интраназальном введении крысам способствовал усилению антикоагу-лянтного и фибринолитического фона их плазмы крови. Leu в этих условиях не вызывал достоверных изменений антикоагулянтной и фибринолитиче-ской активности плазмы.
Во второй части экспериментов in vivo при тромбообразовании вес свежих фибриновых сгустков в сосуде на фоне предварительного введения пептида был ниже на 68.5% по сравнению с контролем. Это происходило на фоне достоверного повышения антикоагулянтной (на 17.4%) и фибринолитической (СФА, НФ и ААП увеличились на 56.4, 69.2 и 34.7% соответственно), табл. 2. Таким образом, при многократном интраназальном введении PGPL проявлял способность предотвращать тромбообразование, т.е. обладал антитромбо-тическими свойствами. В данных условиях экспе-
ЛЕЙЦИНСОДЕРЖАЩИЕ ГЛИПРОЛИНЫ
459
Таблица 2. Показатели системы гемостаза плазмы крови животных и масса сгустков на фоне формирования тромбов после трехкратного интраназального введения пептида Pro-Gly-Pro-Leu и аминокислоты Leu в дозе 1 мг/кг массы тела
Показатели
гемостаза Пептид PGPL, Лейцин, Контроль,
и вес сгуст- n = 8 n = 8 n = 7
ков, %
АЧТВ 117.4 ± 5.5* 98.3 ± 5.1 100.0 ± 5.7
СФА 156.4 ± 15.5** 88.3 ± 5.9 100.0 ± 8.5
НФ 169.2 ± 18.6** 94.1 ± 14.5 100.0 ± 5.3
ААП 134.7 ± 6.16** 98.2 ± 7.4 100.0 ± 7.9
АТ 93.9 ± 14.7 98.1 ± 12.5 100.0 ± 6.0
Масса сгуст- 31.5 ± 6.5** 70.4 ± 15.8 100.0 ± 3.6
ков
римента Leu не оказывал антитромботического действия. Ранее было показано, что пептид PGP при интраназальном введении проявляет антикоа-гулянтно-фибринолитические и антитромбоци-тарные эффекты [9]. Возможно, противосверты-вающие и антитромботические эффекты PGPL обусловлены наличием в структуре его молекулы PGP, а не Leu.
Во второй части работы при исследовании лечебных эффектов PGPL и LPGP на модели гипер-холестеринемии у крыс через 1 ч после последнего введения препаратов установлено снижение уровня ТГ на 0.22—0.24 ммоль/л, повышение уровня ХС ЛПВП на 0.11—0.12 ммоль/л. При этом наблюдалось повышение СФА и НФ на 20—40% и тенденция к возрастанию антикоагулянтной активности по тестам АЧТВ и ТВ (табл. 3). Дополнительные проведенные нами исследования действия PGP и Leu в тех же условиях показали, что PGP оказывает и гипохолестеринемическое, и противосвер-тывающее действие, но по тесту АЧТВ в меньшей степени (на 18%), чем изучаемые лейцинсодержа-щие пептиды. Leu в этих условиях лишь незначительно улучшал липидный профиль и не влиял на
противосвертывающие свойства крови. На основании этого можно говорить, что механизм гипо-холестеринемического действия PGPL и LPGP связан с сочетанным действием PGP и Leu и обусловлен структурными особенностями лейцин-содержащих глипролинов.
Таким образом, при трехмесячном содержании жи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.