ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 4, с. 347-373
УДК 577.153.2
ЛИПАЗЫ В РЕАКЦИЯХ КАТАЛИЗА В ОРГАНИЧЕСКОМ СИНТЕЗЕ
(ОБЗОР)
© 2014 г. А. М. Безбородов, Н. А. Загустина
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: zagust@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 25.10.2013 г.
В обзоре рассмотрены проблемы ферментативного катализа в реакциях органического синтеза, в которых катализатором является липаза. Кратко изложены данные о современных методах белковой инженерии и модификации ферментов, позволяющие расширить круг используемых субстратов. Показано участие липазы в получении лекарственных и агрохимических препаратов, лишенных неактивных энантиомеров, а так же в синтезе энантиомеров вторичных спиртов и оптически активных амидов. Обсуждается вопрос об участии липазы в формировании С—С связи в реакции Михаэля. Представлены данные о ферментативном синтезе конструкционных материалов — полиэфиров, силоксанов и др. Приведены примеры реализации процесса ферментативного катализа в промышленности с участием липазы.
DOI: 10.7868/S0555109914040187
Ферментативный катализ в реакциях органического синтеза становится неотъемлемой составляющей современных технологических процессов. Следует отметить несколько основных его преимуществ:
— широкий диапазон возможных реакций;
— возможность осуществления процесса, в отличие от реакций органического синтеза, в одну ступень (в частном случае), при этом отсутствует необходимость защиты функциональных групп;
— мягкие условия проведения реакций, подходящие для сложных, химически нестойких молекул;
— высокая активность катализатора при его низких концентрациях;
— возможность многократного использования катализатора, например, при иммобилизации клеток;
— полная деградация биокатализатора (фермента) в окружающей среде и его безопасность;
— возможность сокращения или полного исключения побочных продуктов реакции.
Применение ферментов в тонком органическом синтезе оправдано прежде всего в тех случаях, когда молекулы, подлежащие химической перестройке, достаточно сложны и содержат близкие по своим свойствам химические связи, из которых затрагиваться должна только одна (или лишь некоторые). Именно поэтому ферменты незаменимы при синтезе производных из природных веществ, имеющих сложную структуру.
Классические химические синтезы часто приводят к нежелательной смеси рацемических компонентов, что бывает трудно преодолеть метода-
ми органического синтеза. Как известно, оптически чистые изомеры особенно необходимы при синтезе биологически активных соединений.
Одним из наиболее привлекательных ферментов для широкой практической реализации процессов в органическом синтезе является липаза. В последнее десятилетие в белковой инженерии возникло направление исследования методов модификации энзиматической активности с целью расширения субстратной специфичности ферментов, особенно в отношении неприродных соединений, благодаря методам направленной эволюции, ДНК-шафлинга, насыщающего мутагенеза и т.п. Один из наиболее важных ферментов в этих исследованиях — липаза. Липазы, обладая энантиосе-лективностью, позволяют легко решать проблему получения оптически чистых изомеров, что подчас бывает трудно преодолеть методами органического синтеза. Как известно, оптически чистые изомеры, особенно необходимы при синтезе биологически активных соединений. Коммерческие препараты липазы, выпускаемые в настоящее время промышленностью, могут использоваться как биокатализаторы для воспроизведения таких процессов в синтетической органической химии [1—5].
ЛИПАЗА
Одним из наиболее востребованных ферментов в реакциях органической химии является липаза (триацилглицерол-липаза, триацилглицерол: ацилгидролаза (КФ 3.1.1.3) — сериновая гидролаза. Липаза катализирует разложение триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицерина и жирных кислот. В системах с низкой активностью воды ли-
пазы катализируют обратную реакцию — этерифи-кацию глицерина жирными кислотами и ряд других реакций. Активность липазы в отличие от эсте-разы требует связывания фермента на поверхности раздела фаз — липид—вода.
В отличие от многих ферментов липаза обладает чрезвычайно широкой субстратной специфичностью и способностью к восприятию широкого спектра структурно разнообразных сложных жиров, спиртов и карбоновых кислот в качестве субстратов. Липазы стабильны и активны в органических растворителях, не требуют кофакторов, практически не имеют побочных продуктов реакции, большинство липаз, имеющих практическое применение, получено путем микробиологического синтеза, что делает их по стоимости очень доступными. Для многих известных липаз установлена третичная структура, что позволяет осуществлять желаемый дизайн мутантных форм с помощью белковой инженерии.
Липазы показывают высокий уровень энан-тио- и региоселективности при конверсии различных неприродных соединений, как в водных, так и в неводных средах, что имеет практическое значение при получении соединений высокой степени чистоты. Для синтеза фармацевтических препаратов, где оптическая изомерия одного из компонентов имеет решающую роль в лечебном эффекте, высокая энантиоселективность (Е) особенно привлекательна [2].
При оценке липаз, как потенциальных катализаторов в реакциях органического синтеза необходимо иметь в виду классификацию этого фермента, основанную на способности сайт-связывающих структур к распознаванию различных субстратов.
Наибольшие трудности возникают в крупномасштабных промышленных процессах, где имеет место использование соединений с большой молекулярной массой и сложной структурой. Липазы второй и третьей группы привлекают особое внимание исследователей, так как они в большей степени могут быть использованы в промышленных процессах. Липазы, относящиеся ко второй группе, имеют "узкий" туннель для связывания ацильной группы, но имеют более широкий сайт, связывающий спирты (липазы Candida antarctica A, Candida rugosa). Ферменты третьей группы имеют "широкий" ацилсвязывающий сайт, но "узкий" для связывания спиртов (липазы C. antarctica B, Ustillago maydis). Субстраты, содержащие в своем составе ароматические структуры, подвергались гидролизу только липазами C. antarctica B. В ряде экспериментов отмечено, что липазы более активны в отношении спиртозамещенных субстратов, чем на кислотозамещенных [6].
Характерным отличием липазы от других известных ферментов является присутствие в структуре полипептидной цепи липофильного а-спираль-
ного домена петли, выполняющей роль "крышки" для активного центра. Этот домен открывает активный центр (каталитическую триаду) только при связывании фермента с поверхностью раздела во-да—липид (феномен, называемый интерфазной активацией). Необычные кинетические характеристики липаз связывают с наличием данной структуры. Субстратсвязывающие домены у различных липаз высокогомологичны по аминокислотным последовательностям, тогда как остальные части их молекул имеют лишь незначительное сходство [7].
Каталитическая триада, присущая липазам, состоит из серина, как нуклеофила, остатков аспара-гиновой или глутаминовой кислот и гистидина, наблюдается сходство с сериновыми протеазами, но имеются различия в первичной структуре. В а/Р-складках каталитический серин расположен после Р-5 пластины и перед последующей а-спи-ралью, аспартат или глутамат после Р-7 пластины, а гистидин локализован в петле после пластины Р-8 (рис. 1) [8].
Перед изложением механизма действия липаз следует сказать о необычной для других ферментов структуре, возникающей в ходе катализа — "оксиа-нионной дыре" (oxyanion hole). В ходе процесса катализа образуется тетраэдрический интермедиат, который стабилизирован за счет водородных связей с двумя аминокислотами, образуя так называемую оксианионную дыру. Водородные связи образуются между амидными группировками аминокислот в структуре фермента и кислородом карбонильной группы субстрата. Тип оксианионной дыры играет важную роль в проявлении специфичности липаз в отношении их субстратов.
Процесс катализа начинается с реакции аци-лирования. Этот этап состоит в переносе протона между остатками аспартата, гистидина и серина, входящими в каталитическую триаду. При этом происходит активация гидроксильной группы се-рина. Как следствие, гидроксильный остаток се-рина, с последующим возрастанием нуклеофиль-ности атакует карбонильную группу субстрата. Первый тетраэдрический интермедиат образуется с отрицательным зарядом на кислороде карбонильной группы. Оксианионная дыра стабилизирует распределение заряда и восстанавливает энергетический статус тетраэдрического интерме-диата, образуя, по крайней мере, две водородные связи. Затем спиртовая часть (R—OH) освобождается от связи с интермедиатом, в то время как "кислый компонент" субстрата остается ковалент-но связанным с остатком серина в ацилэнзимном интермедиате. Этап деацилирования происходит, когда нуклеофил атакует фермент, освобождая продукт реакции — кислоту и регенерирует фермент. Этот нуклеофил может быть водой в случае гидролиза или спиртом в случае алкоголиза.
аА
Рис. 1. Схема расположения аминокислот каталитической триады липазы. 1 — серин; 2 — аспарагиновая или глутаминовая кислоты; 3 — гистидин. (а-спирали; Р-пластины показаны стрелками) [8].
Таким образом, в ходе реакции гидролиза происходит образование фермент—субстратного комплекса (1), первого тетраэдрического интермедиа-та (2), фермент—ацильного комплекса (3), второго тетраэдрического интермедиата (4, рис. 2) [8, 9].
МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ ФЕРМЕНТОВ
Расширение сферы применения ферментов в процессах биокатализа привело к необходимости модификации их структуры. Востребованными оказались методы белковой инженерии, позволяющие осуществлять замены аминокислот в полипептидной цепи, что в итоге приводит к изменению функциональных свойств макромолекул фермента. На уровне клеток происходит процесс неспецифического мутагенеза с последующим отбором мутантов, обладающих необходимыми характеристиками. В основе лежат методы, получившие название направленной эволюции. Направленная эволюция представляет собой один из мето
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.