ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.31.27.19
ЛИПИДНЫИ И ЖИРНОКИСЛОТНЬШ ПРОФИЛИ ДНК-СВЯЗАННЫХ ЛИПИДОВ PSEUDOMONAS AURANTIACA ПО ДАННЫМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ © 2015 г. Р. И. Жданов*, **, 1, Д. Керн***, В. Лоренц***, М. Я. Ибрагимова*
*Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань **Московский государственный гуманитарный университет, Институт перспективных исследований, Москва ***Университет им. Мартина Лютера, Халле-Виттенберг, Германия Поступила в редакцию 27.05.2014 г.
В работе впервые реализован подход к определению липидома хроматина прокариотической клетки, основанный на изучении липидного состава слабо (фракция 1) и прочно (фракция 2) ДНК-связанных липидов клеток Pseudomonas aurantiaca методом электроспрэй ионизации с использованием масс-спектрометрии (ESI-LC-MS). Этим методом мы обнаружили свободные жирные кислоты Ci6.o, Ci8.i (фракция 1) и C14.0, Ci6-i, Ci8.2 (фракция 2). Для обеих фракций ДНК-связанных липидов характерно содержание фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина и лизо-фосфатидилинозитола. В спирторастворимой фракции 1 могут содержаться также фосфатидилхолин и фосфатидилинози-тол, а во фракции 2 прочносвязанных липидов, вероятно - триацилглицерины. Метод ESI-LC-MS расширяет возможности исследования липидома нуклеоида по сравнению с газовой хроматографией, что позволит полнее исследовать функцию ДНК-связанных липидов в бактериальной клетке.
Ключевые слова: Pseudomonas aurantiaca, ДНК-связанные липиды, жирные кислоты, масс-спектро-метрия, электроспрэй ионизация.
DOI: 10.7868/S0026365614060238
Липидомика заняла прочное место в постгеномных науках [1—8], однако в используемых протоколах исследования липидома не учитывается особая группа липидов, а именно, липиды, c разной степенью прочности связанные с ДНК [9, 10]. Вместе с тем, изучение таких ДНК-связанных липидов представляет большой интерес в связи с данными о сигнальной роли липидов в прокарио-тических и эукариотических клетках [11] и регуляции активности генов липидами [12, 13]. В экспериментах по титрованию липидами поли-нуклеотидов ДНК с различной нуклеотидной последовательностью была обнаружена си-квенс-специфичность связывания липидов с ДНК [14]. Оказалось, что жирные кислоты взаимодействуют с АТ-богатыми последовательностями на основе узнавания (одна молекула липи-да на виток ДНК = 10 п.о.), а с CG-богатыми последовательностями ДНК — по принципу насыщения (вплоть до соотношения 1 молекула липида на 2 п.о.) [14]. Сложный фосфолипид кар-диолипин может взаимодействовать с полинук-леотидами ДНК независимо от их нуклеотидной
1 Автор для корреспонденции (e-mail: zrenad@gmail.com).
последовательности [7, 15]. Показано, что содержание кардиолипина повышено в активных геномах пролиферирующих клеток, где высок уровень экспресии генов [16].
В предыдущих работах методом газовой хроматографии нами был исследован жирнокислот-ный профиль двух фракций ДНК-связанных липидов грамотрицательной бактерии Pseudomonas aurantiaca после выделения их из геномной ДНК в присутствии детергентов [17—19]. Впервые было показано, что даже в таких жестких условиях выделения в препаратах геномной ДНК обнаруживаются ДНК-связанные липиды, профиль которых и был исследован [18, 19]. Обработкой прокариоти-ческого надмолекулярного комплекса геномной ДНК (высокомолекулярная ДНК, вмДНК), содержащего четыре типа биомакромолекул — ДНК, РНК, белки и липиды, ферментами ДНКа-зой, РНКазой и протеазой с последующим анализом жирнокислотного состава методом газовой хроматографии нами были идентифицированы жирные кислоты, связанные по преимуществу с ДНК, РНК или белками [20].
Однако данные о липидном профиле ДНК-связанных липидов и их функциях в прокариоти-
ческой клетке к настоящему времени скудны и противоречивы [9, 10, 21]. Методом тонкослойной хроматографии было обнаружено, что ДНК-связанные липиды E. coli и Shigella sonnei (термолабильный штамм) содержат как нейтральные липиды (0.78 и 0.92 вес. % от МСК соответственно), так и фосфолипиды (0.11 и 0.14 вес. % от МСК, соответственно) [9, 21, 22]. Фосфолипиды этих бактерий представлены, по-видимому, кар-диолипином (КЛ) и фосфатидилэтаноламином (ФЭ) [21]. Было показано, что свойства вмДНК Pseudomonas aurantiaca (мол. масса и эластовяз-кость) и жирнокислотный состав ДНК-связанных липидов бактерий зависят от фазы роста их культур, достигая более высоких значений в стационарной фазе [23, 24]. Таким образом, липиды участвуют, вероятно, в суперспирализации петель геномной ДНК прокариот. От физиологического возраста (фазы роста) бактерий зависела и их способность к рецепции алкилоксибензолов, природных ауторегуляторов бактерий, которые принимают участие в контроле диссоциативных переходов, обусловленных внутригеномными перестройками [23]. На основе всего массива данных о ДНК-связанных липидах предложена гипотеза о существовании липидного кода геномной ДНК, предполагающего, что в ДНК липиды связаны в специфической последовательности [25].
Цель нашей работы — определение жирнокис-лотного и липидного состава прочно- и слабосвязанных с ДНК липидов в клетках P. aurantiaca (стационарная фаза) методом масс-спектромет-рии с использованием электроспрэй ионизации (ESI-LC-MS).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все реагенты были аналитически чистые ("Merck", "Sigma", "Bohringer Manheim GmbH"), в качестве метилирующего агента был использован гидроксид триметилсульфония, TMSH ("Ma-cherey & Nagel", Германия). Для приготовления всех растворов использовали бидистиллирован-ную воду milliQ. Органические растворители перегоняли непосредственно перед использованием.
Среды и условия культивирования. Объектом исследования служила грамотрицательная бактерия Pseudomonas aurantiaca B-1558 (ВКМ) (Всероссийская коллекция микроорганизмов, Пущи-но, Московская область). Анализировали липиды клеток культуры стационарной фазы роста (48 ч культивации) [4, 16—21, 23, 24], выращенной в синтетической питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза — 2; КН2РО4 • 3Н2О — 0.1; (NH4)2SO4 - 0.5; K2HPO4 • H2O - 1; CaCl2 - 0.2; MgSO4 • 7H2O — 0.1; дрожжевой экстракт "Difco" — 0.05; микроэлементы (мг/л): FeSO4 • 7H2O — 20;
MnCl2 • 4H2O - 20; ZnSO4 • 7H2O - 0.4; B(OH)3 -0.5; CuSO4 • 5H2O - 0.05; Na2MoO4 • 2H2O - 0.2; pH после стерилизации 7.25. Бактерии растили при 28°C в колбах объемом 2 л (500 мл среды) на качалке (140 об/мин). Чистоту культуры проверяли микроскопированием и при высеве на чашки Петри с агаризованной средой LB. В качестве инокулята использовали культуру клеток стационарной фазы, выращенных в среде приведенного состава. Инокулят вносили в количестве, дающем начальную оптическую плотность суспензии 0.1 OD (X = 540 нм, /кюветы = 10 мм). Массу сухих клеток (МСК) определяли после их высушивания при 105°C до постоянного веса.
Выделение вмДНК. Препараты высокомолекулярной ДНК (вмДНК) выделяли из клеток бактерии мягким фенольным методом [16-21]. К суспензии клеток в растворе 0.14 М NaCl (pH 7.0) добавляли равный объем 66% водного раствора свежеперегнанного фенола, рН 8.5, и дважды экстрагировали, аккуратно перемешивая на круговой качалке (60 об/мин) 1 ч с последующим центрифугированием 20 мин при 5000 g [21]. Содержащую ДНК верхнюю фазу отбирали, добавляли равный объем 66% фенола (рН 8.5), перемешивали 20 мин и центрифугировали 1 ч при 5000 g. Раствор ДНК диализовали против 0.14 М NaCl (pH 7.0) при 4°C в течение 3 сут. Содержание ДНК и РНК определяли спектрофотометрически по методу Спирина, молекулярную массу и эластовязкость вмДНК измеряли как описано ранее [19, 21]; полученный препарат вмДНК имел те же характеристики, что и препарат, выделенный в работе [24]: содержание ДНК 10.7 мг/г МСК, мол. масса 19 х х 104 кДа и эластовязкость 770 ± 24 дл/г.
Выделение фракций ДНК-связанных липидов.
Две фракции ДНК-связанных липидов из вмДНК были выделены как описано ранее [18,19]. Фракцию слабосвязанных (спирторастворимых) липидов (фракция 1) экстрагировали из вмДНК 35% водным раствором этанола (24 ч при 37°C). После инкубации ДНК быстро осаждали двойным объемом холодного 96% этанола, 3 раза промывали 70% этанолом, этанольные экстракты соединяли. Растворители упарили при 40°C, остаток растворили в смеси хлороформ/метанол (1 : 2 по объему) и получили фракцию слабосвязанных липидов (фракцию 1). Осажденную этанолом ДНК инкубировали с ДНКазой I (1 : 1 весу), не содержащей липидов ("Sigma"), в 5 мл раствора 0.01 М хлористого магния 2 ч при 37°C. Экстракцию прочно-связанных липидов (фракция 2) из этой смеси проводили по методу Блая - Дайера как описано ранее [19].
Жидкостная хроматография и масс-спектроско-пия фракций ДНК-связанных липидов. Масс-
Таблица 1. Липиды, обнаруженные во фракции 1 спирторастворимых ДНК-связанных липидов Pseudomonas aurantiaca*
№ пиков m/z пика Время выхода, мин Электр. режим, условия Идентификация Теорет. масса иона, Да Примечания
1 255.3 8.380 Отр., рН 7 Анион С16:0 255.4228 Один пик
2а, 2б 255.4/281.5 8.606 Отр., рН 7 Анионы С16:0/С18:1 255.4228 281.4608 Два пика
2а, 2б 255.3/281.5 8.832 Отр., рН 7 Анионы С16:0/С18:1 255.4228 281.4608 Два пика
3а, 3б 621.4/623.2 29-30 Полож. Лизо-ФИ 598.6687 (-2Н) 600.6867 +23 (№) Дублет ионов
4 745.6 30 Отр. ФГ(С16:0/С18:2) 747.0018 2Н+
5 798.6/803.8 36.47 Полож. ФГ(С18:1/С18:1)/ФГ (WC^) 775.0552/ 803.0910 +23 (№)
6 747.8 37.7-39 Полож. ФГ (С16:1, С18:1) 747.0018 16:0, 18:2
7 736.6 44 Полож. ФС (C16:0) 733.9631 +2Н+
8 760.8 59.49-60.16 Полож. ФХ (С16:0, С18:1) 760.859 -
9 891.1 >60 Полож. ФИ (С18:А/С18:С) 867.1513 +23 (№)
* Сокращения: Отр. — режим отрицательной ионизации (negative mode); Полож. — режим положительной ионизации; ФГ — фосфатидилглицерин; ФС — фосфатидилсерин; ФХ — фосфатидилхолин; ФИ — фосфатидилинозит; Лизо-ФИ — лизофосфа-тидилинозит.
спектры пиков фракций ДНК-связанных липидов фракций 1 и 2 регистрировали на приборе модели LC-ESI-MS (масс-спектрометр API2000, "Applied Biosystems", США) (turbo spray) в режиме отрицательной (negative mode, — Q1) или положительной ионизации (positive mode, +Q1); 350°C [26, 27]. Растворители из липидных фракций удаляли и остаток высушивали под вакуу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.