ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.11.22
ЛИПОПОЛИСАХАРИД ESCHERICHIA COLIМ-17 © 2012 г. Л. Д. Варбанец*, 1, Э. А. Здоровенко**, Е. Г. Гаркавая***, О. С. Броварская*
*Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАНУкраины, Киев **Институт органической химии им. Д.Н. Зелинского РАН, Москва ***Национальный авиационный университет, Киев Поступила в редакцию 11.04.2011 г.
Выделен и изучен липополисахарид (ЛПС) Escherichia coli M-17, проведена его химическая идентификация, показано, что он является малотоксичным и непирогенным. Изучение влияния исследуемого ЛПС на Т- и В-лимфоциты позволяет предположить, что он может быть использован как ми-тоген в реакциях бласттрансформации, поскольку по активности лишь в незначительной степени уступает коммерческому препарату. В реакциях двойной иммунодиффузии в агаре по методу Оух-терлони показано, что ЛПС E. coli M-17 в гомологичной системе проявляет активность антигена и в перекрестных серологических реакциях не взаимодействует с антисыворотками к представителям других видов Enterobacteriaceae — Budvicia aquatica, Rahnella aquatilis, Pragia fontium. В результате мягкого кислотного гидролиза получены структурные компоненты молекулы липополисахарида: ли-пид А, коровый олигосахарид и О-специфический полисахарид. На основании данных моносаха-ридного состава и спектров ХЫ и 13C ЯМР установлено, что О-специфический полисахарид имеет структуру, характерную для представителей E. coli серогруппы О2:
— 3 )-a-L - Rhap - (1— 2 )-a-L - Rhap-(1 —3)-0-L - Rhap - (1— 4 - D-Glcp NAc-(1—
2
t
1
a-D-Fucp3NAc
Ключевые слова: Escherichia coli, липополисахарид, биологическая активность, О-специфический полисахарид, структура.
Липополисахариды (ЛПС) — специфические компоненты клеточной оболочки грамотрица-тельных бактерий, расположены на внешней поверхности наружной мембраны грамотрицатель-ных бактерий и выполняют ряд важных для клетки физико-химических и биологических функций: играют значительную роль в поддержании целостности мембраны, регулируют ее проницаемость для разных веществ, принимают участие в контактах микроорганизма с другими микро- и макроорганизмами. Благодаря поверхностному расположению и особенностям строения ЛПС определяют О-антигенную специфичность бактерий [1].
Молекула ЛПС состоит из трех структурных компонентов: О-специфического полисахарида (ОПС), олигосахарида кора (ОГ-кор) и липида A. Липид A — наиболее консервативная часть молекулы ЛПС, содержит необычные жирные кислоты, состав которых является довольно стабильным показателем в пределах одного вида, поэтому может быть использован как один из дополнительных хемотаксономических критери-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: varbanets@
serv. imv. kiev. ua).
ев. С липидом А связан олигосахарид кора, менее консервативная часть молекулы ЛПС, которая содержит специфические моносахариды, такие как 2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота (КДО) и гептозы [2].
Наиболее вариабельная часть молекулы ЛПС, которая отвечает за антигенную специфичность бактериальной клетки, — О-специфические по-лисахаридные цепи, отличающиеся у разных штаммов бактерий по составу и структуре. Они легко распознаются антителами хозяина, поэтому, чтобы избежать ответа иммунной системы хозяина, бактерии изменяют структуру ОПС.
Поскольку ЛПС являются эндотоксинами микробной клетки, их попадание в организм высших животных и человека вызывает широкий спектр эндотоксических активностей, которые могут приводить к септическому шоку. Благодаря этим свойствам ЛПС вносят вклад в патогенный потенциал грамотрицательных бактерий, вследствие чего они являются одними из факторов развития тяжелых инфекционных заболеваний.
Вместе с тем известно [3], что ЛПС способны активировать В- и Т-лимфоциты, гранулоциты, моноядерные клетки, поэтому они рассматриваются как потенциальные иммуномодуляторы. Ряд фирм ("Sigma", "Serva") выпускает коммерческие препараты ЛПС, в основном ЛПС Escherichia coli, однако, эти препараты довольно дорогостоящи.
Целью данной работы было химически охарактеризовать липополисахарид E. coli M-17 и оценить его биологическую активность.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования был штамм E. coli M-17 (входящий в состав препаратов пробиотиков "Бификол" и "Колибактерин"). Бактерии выращивали на твердой среде МПА в течение 24 ч при 28—30°С. Клетки собирали центрифугированием (20 мин, 5000 g), высушивали обработкой ацетоном и эфиром.
Выделение ЛПС. ЛПС экстрагировали из высушенных клеток 45% водным раствором фенола при 65—68°С. Полученные водные фракции диа-лизовали против водопроводной, а затем дистиллированной воды для удаления фенола [4].
Определение содержания углеводов, нуклеиновых кислот и белка. Количество углеводов определяли методом Дюбуа [4]. Оценку результатов осуществляли по изменению окраски при реакции фенола с серной кислотой на спектрофотометре при 490 нм. Содержание углеводов определяли в соответствии со стандартными калибровочными кривыми, которые строили по глюкозе.
Содержание нуклеиновых кислот оценивали по методу Спирина [4], белков — Лоури с использованием реактива Фолина [4].
Идентификацию нейтральных моносахаридов проводили после гидролиза препаратов в 2 M НС1 (5 ч, 100°С). Моносахариды анализировали в виде ацетатов полиолов [5] на хромато-масс-спектро-метрической системе Agilent 6890/5973N, колонка DB-225mS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), газ-носитель — гелий, поток через колонку — 1 мл/мин. Температура испарителя — 250°С, интерфейса — 280°С, термостата — 220°С (режим изотермический). Моносахариды идентифицировали, сравнивая время удерживания ацетатов полиолов исследуемых образцов со стандартными, а также используя компьютерную базу данных ChemStation. Количественные соотношения отдельных моносахаридов выражали в процентах от общей суммы площадей пиков.
Определение жирнокислотного состава осуществляли после гидролиза образца в 1.5% растворе хлористого ацетила в метаноле (100°С, 4 ч), и метиловые эфиры жирных кислот анализирова-
ли на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890N/5973 inert, колонка HP-5MS, длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина фазы 0.25 мкм, температурный режим 150—250°С, градиент температуры 4°С, газ-носитель — гелий, скорость потока через колонку 1.2 мл/мин. Температура испарителя 250°C, распределение потока 1 : 100. Идентификацию жирных кислот проводили с помощью базы данных персонального компьютера, а также стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот.
ЯМР-спектроскопия. Спектры ЯМР снимали для раствора ОПС в 99.95 D2O при 30°C на спектрометре Bruker Avance II 600 (Германия), используя 3-триметилсилипропионат-2,2,3,3-ё4 (SH 0 м.д.) и ацетон (SC 31.45 м.д.) в качестве внутренних стандартов. Перед съемкой спектров образцы лиофилизовали из 99.5% D2O.
Пирогенность ЛПС определяли на кроликах весом 2.0—3.5 кг [4]. Термометрию проводили с помощью электронного термометра ("Omron Matsusaka Co. Ltd", Япония), который вводили в прямую кишку на глубину 5—7 см (в зависимости от веса кролика). Предварительно всех кроликов испытывали на иммунореактивность путем внутривенного введения 10 мл/кг 0.9%-ого стерильного непирогенного раствора хлорида натрия. Исследуемые препараты ЛПС растворяли в стерильном непирогенном изотоническом растворе, перед введением выдерживали в течение 10 мин при 37°С, после чего внутривенно вводили из расчета 1 мл/кг веса животных. Минимальную пирогенную дозу препаратов ЛПС определяли в серии разведений от 0.5 до 1.0 х 10-2 мг/мл. Каждую серию исследованных растворов проверяли на 3-х кроликах, близких по весу (разница не более чем 0.5 кг).
Перед введением раствора ЛПС у кроликов дважды измеряли температуру с интервалом 30 мин. Поскольку разница в показателях температуры не должна превышать 0.2°С, животных, которые не отвечали этому показателю, для исследований не использовали. Результат последнего измерения принимали за исходную температуру. Раствор ЛПС вводили не позднее, чем через 15—20 мин после последнего измерения температуры. Последующие измерения проводили после введения препарата трижды с интервалом в 1 ч. Исследованный раствор ЛПС считали непиро-генным, если суммарная величина повышения температур за 3 ч была меньшей или равнялась 1.4°С.
Определение токсичности ЛПС проводили на здоровых белых беспородных мышах весом 19—21 г обоих полов, ранее не использованных в каких-либо экспериментах и сенсибилизированных га-лактозамином. Для этого мышам вводили внут-рибрюшинно 0.5 мл 3.2% раствора D-галактоза-
ЛИПОПОЛИСАХАРИД ESCHERICHIA COLI М-17
355
мингидрохлорида в непирогенном стерильном растворе 0.9% NaCl. После этого тотчас же вводили внутрибрюшинно 0.2 мл подогретого до 37°С ЛПС в изотоническом стерильном непирогенном физиологическом растворе со скоростью 0.1 мл/с. В серии разведений ЛПС определяли дозу препарата, которая вызывала гибель 50% исследуемых животных (ЛД50), ее значение использовали для оценки токсичности ЛПС. Как в контрольной, так и в опытных группах использовали по десять мышей. Мышам контрольной группы вводили вместе с D-галактозамин-гидрохлоридом 0.2 мл стерильного раствора 0.9% NaCl. Наблюдения за животными проводили в течение 48 ч [4].
Иммунологические исследования. О-антисыво-ротку получали к прогретым (2.5 ч, кипящая водяная баня) клеткам E. coli. Кроликов иммунизировали внутривенно пятикратно, с интервалом 4 дня, концентрация клеток составляла 2 х 109/мл (от 0.1 до 1 мл).
Антигенную активность ЛПС исследовали методом двойной иммунодиффузии в агаре по Оух-терлони [6].
Влияние ЛПС на разные популяции лимфоцитов изучали по уровню экспрессии CD3- и CD22-рецепторов на Т- и В-лимфоцитах с помощью реакции розеткообразования с моноклональными антителами к вышеуказанным рецепторам. В круглодонные лунки иммунологического планшета или микропробирки вносили 0.25 мл (25 мкл) CD-диагностикума антител и добавляли равный объем лимфосмеси, инкубировали 25 мин при 37°С, центрифугировали при 500—1000 g 3 мин и помещали на 1 ч при 4°С в холодильник. Осадки лимфоцитов, обработанные монокло-нальными антителами, высушивали, фиксировали
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.