УДК 612.017.1:616.94
ЛИПОПОЛИСАХАРИД ИЗ Rhodobacter capsulatus ОБЛАДАЕТ АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ЭФФЕКТОВ ТОКСИЧНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И ПОДАВЛЯЕТ ВЫСВОБОЖДЕНИЕ TNF-a, IL-6 и IL-1P В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
© 2013 г. Е. В. Волошина*, Н. И. Косякова, И. Р. Прохоренко
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 2;
*электронная почта: e-mail:ewgenia.w@yandex.ru Поступила в редакцию 01.04.2013 г.
Тяжесть патологического процесса при грамотрицательном сепсисе зависит от интенсивности ответа клеток крови человека на структурные компоненты бактерий — липополисахариды (ЛПС). Результатом этого ответа является генерализованная воспалительная реакция организма, обусловленная повышенной продукцией провоспалительных цитокинов. Один из разрабатываемых сегодня подходов к предупреждению развития воспалительной реакции — блокирование связывания ЛПС с рецепторами клеток-мишеней. Нами изучена эффективность антагонистического действия ЛПС из Rhodobacter capsulatus в отношении токсичных ЛПС из Salmonella typhimurium и из Escherichia coli, оцениваемая по синтезу провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-6 и IL-ip. R. capsulatus в концентрации 0.1 и 1 мкг/мл не обладал способностью индуцировать синтез TNF-a, IL-6 и IL-ip. Измерение уровня цитокинов показало, что ЛПС из R. capsulatus защищают от действия токсичных ЛПС. Более выраженное антагонистическое действие ЛПС из R. capsulatus проявлял в отношении ЛПС из S. typhimurium: наблюдалось полное блокирование синтеза TNF-a и IL-ф и значительное снижение уровня IL-6. ЛПС из R. capsulatus проявлял свойства антагониста и в отношении ЛПС из E. mli: наработка TNF-a полностью подавлялась, уровень IL-6 снижался на 60%, а IL-ф — на 70%. Таким образом, ЛПС из R. capsulatus способен в разной степени блокировать активацию клеток токсичными ЛПС.
Ключевые слова: липополисахарид из Rhodobacter capsulatus, антагонист, провоспалительные цито-кины, цельная кровь человека.
Б01: 10.7868/$023347551305023Х
Эндотоксиновый шок при грамотрицательной инфекции является частой причиной летальных исходов. В патогенезе грамотрицательной инфекции основную роль играют бактериальные эндотоксины (липополисахариды, ЛПС). Причиной появления свободных эндотоксинов в крови могут быть инфекционные осложнения при травмах, ожогах, операциях. В свободном состоянии ЛПС способны взаимодействовать со специфическими рецепторами на поверхности клеток-мишеней организма (нейтрофилы, моноциты/макрофаги, эн-дотелиальные клетки и т.д.), которые в ответ на ЛПС синтезируют провоспалительные цитокины ТЫР-а, 1Ь-1р, 1Ь-6, 1Ь-8 и др. Избыточный синтез этих цитокинов приводит к активации клеток различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме. Несмотря на многолетние научные исследования, эффективное средство, способное предотвращать развитие патологической реакции в ответ на ЛПС, в настоящее
время не создано. Многообещающим подходом в превентивной терапии септического шока считается использование антагонистов на базе ЛПС, которые, конкурентно связываясь с рецепторами, блокируют передачу сигнала в клетку от эндотоксина и тем самым предотвращают развитие неконтролируемой воспалительной реакции организма. Основные требования к антагонистам — слабая биологическая активность и способность конкурировать с токсичными ЛПС за связывание с рецепторами на поверхности клеток. В нашей лаборатории был получен штамм Rhodobacter capsulatus PG (ЛПСд.^.), ЛПС которого слабо влиял на ранее исследуемые нами функциональные активности клеток, а также был способен защищать клетки от некоторых эффектов эндотоксинов. В опытах in vitro показано, что ЛПС^^. проявляет свойства антагониста, отменяя эффект прайми-рования, адгезию и апоптоз нейтрофилов, индуцированные токсичным ЛПС Escherichia coli (ЛПСЕ. col¡). [1, 2]. В опытах in vivo на крысах линии
Wistar показано, что предварительное введение в кровь ЛПСД са^ снижало смертность крыс при последующем введении ЛПС Salmonella typhimuri-um (ЛПС^ yph;mu™m) [3]. В настоящее время неизвестно, способен ли ЛПСд.^. в одинаковой мере подавлять синтез цитокинов в ответ на эндотоксины разной структуры. В связи с этим целью работы было определить эффективность антагонистического действия ЛПСд.^. в отношении способности токсичного RnCSJyphimurium или ЛПСЕ соП индуцировать синтез провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-6, IL-1ß.
При попадании в кровь ЛПС может взаимодействовать с компонентами крови, в частности, с белками и липопротеинами [4], которые влияют на цитокиновый ответ клеток. Работа с изолированными клетками не позволяет учесть это влияние, поэтому мы проводили опыты на цельной крови.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В работе использовали ЛПС из S. typhimurium и E. coli O55:B5 (Sigma, США). ЛПС из R. capsulatus получали по модифицированной методике Вестфаля [5]. Использовали культуральную среду RPMI 1640 с Z-глутамином, тестированную на эндотоксины (Sigma, США), пенициллин, стрептомицин (ОАО Биохимик, Россия), иммуноферментные тест-системы для определения TNF-a, IL-1 ß и IL-6 человека (ООО Цитокин, С.-Петербург, Россия).
Подготовка препаратов ЛПС и среды для культивирования крови. Навеску ЛПС растворяли в апирогенной воде для инъекций и разводили до конечной концентрации 10 мкг/мл. Непосредственно перед добавлением к образцам крови водный раствор ЛПС озвучивали в течение 20 мин в ультразвуковой ванне (Афалина, Россия). К среде RPMI 1640 в стерильных условиях добавляли пенициллин до конечной концентрации 100 ЕД/мл и стрептомицин — 100 мкг/мл.
Активация клеток крови ЛПС. Эксперименты были выполнены на цельной крови 9 доноров (мужчины и женщины в возрасте 20—27 лет). Кровь в стерильных условиях забирали в гепари-низированные пробирки Monovette (Sarsted, Германия). Нами проведены две серии опытов. В первой серии для выяснения влияния ЛПС разной структуры на синтез TNF-a, IL-1ß и IL-6 образцы крови разводили средой RPMI 1640 (1/10) и разносили в 24-луночные планшеты (Greiner, Австрия). Затем добавляли разные ЛПС: ЛПСЕсой, ЛПСs.typhlmurшm или ЛПСr в конечной концентрации 0.1 мкг/мл и инкубировали в течение 24 ч при 37°C в присутствии 5% CO2. Далее планшеты центрифугировали (900 g, 5 мин), супернатанты отбирали, замораживали и хранили при — 20°C до измерения уровня цитокинов.
Во второй серии исследовали антагонистическое действие ЛПС^^. Образцы крови, разведенные средой RPMI 1640 (1/10), разносили в 24-луночные планшеты и предварительно в течение 30 мин инкубировали с ЛПСЛс™ (1 мкг/мл); затем добавляли ЛПС£со,; или ЛПСSJyp1limurium в концентрации 0.1 мкг/мл. Инкубировали в течение 24 ч при 37°C в присутствии 5% CO2. Далее планшеты центрифугировали (900 g, 5 мин), су-пернатанты отбирали, замораживали и хранили при —20°C.
Определение уровня цитокинов в образцах. Во
все лунки планшета вносили по 100 мкл буфера, входящего в состав коммерческого набора для измерения цитокинов. В соответствующие лунки планшета вносили по 100 мкл калибровочных проб с известной концентрацией исследуемого цитокина или образцов (в дубликатах) и инкубировали в течение 2 ч при 37°С при непрерывном встряхивании. После инкубации лунки трижды промывали 300 мкл промывочного буфера. Далее в лунки планшета вносили по 100 мкл меченных биотином антител и инкубировали в течение 1 ч со встряхиванием при 37°С. После инкубации лунки трижды промывали 300 мкл промывочного буфера. Вносили по 100 мкл конъюгата стрепта-видина с пероксидазой хрена и инкубировали в течение 30 мин при 37°С со встряхиванием. Далее лунки трижды промывали, внося в каждую из них по 300 мкл промывочного буфера, и 1—2 раза дистиллированной водой. Во все лунки добавляли по 100 мкл раствора субстратной смеси и инкубировали в течение 15—20 мин при комнатной температуре в темноте. Останавливали реакцию добавлением 50 мкл раствора 1 н серной кислоты. Измеряли оптическую плотность образцов в лунках с помощью иммуноферментного анализатора (STAT FAX 3200, США) при длине волны 450 нм. Минимальная достоверно определяемая тест-системой концентрация цитокинов в образцах составляла для TNF-a — 1 пг/мл, для IL-1p — 6 пг/мл и для IL-6 — 5 пг/мл.
Обработка результатов. Количественную оценку результатов проводили с использованием калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности от концентрации цитокина. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение по результатам 9 независимых экспериментов для IL- 1р, 6 для IL-6 и 5 независимых экспериментов для TNF-a. Статистическую значимость различий между группами устанавливали по критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ЛПС-индуцированный синтез IL-1fi, TNF-a и
IL-6. Как ЛПС разной структуры влияют на синтез провоспалительных цитокинов? Чтобы выяснить это Л П СЕ. coii, ЛПС£ typhimurium и ЛПСКЬ.сарз.
(0.1 мкг/мл) добавляли в разведенную кровь и ин-
кубировали в течение 24 ч. Эффекты ЛПСS.typhimurium или ЛПСЕ соН на продукцию IL-1P были сравнимы (3390 ± 370 и 3212 ± 423 пг/мл соответственно), тогда как ЛПСя.^. не стимулировал синтез IL-1P (рис. 1а). Уровни TNF-a после стимуляции токсичными ЛПС также были сравнимы: 790 ± 312 пг/мл после стимуляции ЛПСS.typhimurium и 692 ± 208 пг/мл после стимуляции ЛПС^, ЛПС^^. не активировал клетки к синтезу TNF-a (рис. 1б). Уровень IL-6 после стимуляции ЛПСS.typhimurium или ЛПСEcoli были сравнимы (3535 ± 356 и 3424 ± 392 пг/мл соответственно). Уровень IL-6 в крови после добавления ЛПС
R. caps.
был сопоставим с уровнем в контроле (рис. 1в).
Антагонистические эффекты ЛПС из R. capsulatus. В данной серии опытов концентрацию ЛПС
R..caps.
увеличивали в 10 раз. Образцы крови предварительно инкубировали с ЛПСЛс£ру>, затем добавляли токсичный ЛПСКсои или ЛПС^.^тшшт. ЛПСЛсарл проявлял свойства антагониста в отно-
так и ЛПСЕ сЫ. Измере-
шении как ЛПС
S. typhimurium " " " ^ ^e. coli'
IL-1ß показало, что ЛПС
ние содержания
R. caps.
полностью защищает клетки крови всех доноров от действия токсичного ЛПСStyphimufium. При использовании ЛПСЕсоН антагонистический эффект
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.