ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 558-566
УДК 576.8.095
ЛИЗОЦИМ МОЛЛЮСКА Unio pictorum И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К НЕМУ
АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ
© 2004 г. Г. Н. Соловых*, В. П. Коробов**, И. В. Карнаухова*, Л. М. Лемкина**, Е. И. Ушакова*, Г. М. Устинова*, В. В. Минакова*
*Оренбургская государственная медицинская академия, Оренбург, 460000;
e-mail: Kopylov@osma.ru **Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081;
e-mail: korobov@ecolodgy.psu.ru Поступила в редакцию 18.08.2003 г.
Методом сорбции на хитине получен препарат лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Unio pictorum. Изучены его физико-химические свойства. Проведена оценка чувствительности к лизоциму моллюсков Unio pictorum 48 штаммов родококков из Региональной профилированной коллекции алка-нотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, выщеленных из разных природных водных источников, относящихся к 3 видам: Rhodococcus ruber, R. luteus, R. erythropolis. Обнаружена неодинаковая чувствительность всех 3 видов к лизоциму моллюсков. Выявленная высокая резистентность родококков к лизоциму свидетельствует об их широких возможностях к сохранению в гидробиоценозе и соответственно к поддержанию способности микробиоценоза к самоочищению от углеводородов.
В последнее десятилетие отмечается значительное повышение интереса исследователей к представителям рода КНойососст. Это обусловлено биологическими особенностями данных микроорганизмов - используют в качестве единственного источника углеродного питания газообразные и жидкие углеводороды и их широким распространением в разных природных субстратах: почва, подземные и поверхностные воды, воздух, донные отложения и глубинные породы [1, 2]. Способность многих видов родококков деградировать предельные, ароматические, полициклические и галогензамещенные углеводороды свидетельствует о том, что они могут играть важную роль в утилизации этих соединений в биосфере [3, 4]. Однако, занимая определенную экологическую нишу в биоценозе, родококки испытывают воздействие как абиотических, так и биотических факторов водной среды, то есть деятельность этих микроорганизмов тесно связана с экологической обстановкой биосферы, ее физическими и химическими особенностями и со всем комплексом гидробионтов.
В исследованиях [5-8] показано проявление лизоцимной активности у гидробионтов, а также обосновано ее участие во взаимоотношениях гидробионтов с бактериями в гидробиоценозах. Выделен и изучен препарат лизоцима гидробионта двустворчатого моллюска и то рШогыт [9, 10]. Исходя из широкого распространения родококков в природных водоемах и обнаружения у гидробионтов лизоцима, его участия в процессах самоочищения водоемов [11], встает вопрос об оценке степени чувствительности или устойчиво-
сти родококков к воздействию лизоцима гидробионтов, так как от этого зависит их выживание в водоемах, а это в свою очередь определяет способность водоемов к самоочищению от углеводородов и их производных.
Цель работы - оценка чувствительности родококков к лизоциму моллюска Unio pictorum.
МЕТОДИКА
Объекты исследования - коллекционные культуры алканотрофных родококков видов Rhodococcus ruber, R. luteus, R. erythropolis и препарат лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Unio pictorum. Рабочая коллекция включала 48 штаммов, относящихся к роду Rhodococcus из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, выделенных из разных природных водных источников (табл. 1).
Ферментный препарат лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Unio pictorum был получен из гомогената тканей моллюска методом специфической сорбции на хитине [12, 13]. Экстракт тканей моллюска готовили путем растирания материала (жабры, мантия, мышечная ткань, внутренности) в 0.1 М фосфатном буфере, рН 6.2, с кварцевым песком с добавлением ингибитора про-теаз - фенилметилсульфонилфторида (300 мкг/мл). Гомогенат подвергали замораживанию и оттаиванию; центрифугировали при 9000 g в течение 15 мин. Осадок отбрасывали. В полученном экстракте определяли литическую активность турби-
Таблица 1. Алканотрофные микроорганизмы (Региональная профилированная коллекция ИЭГМ, г. Пермь)
Штамм
Источник
АС 71, АС 83, АС 90, АС 92
АС 219, АС 221, АС 222
АС 220
АС 325
АС 347
АС 348
АС 377
АС 380, АС 383, АС 384, АС 385, АС 386
Rhodococcus ruber ИЭГМ:
Вода, озеро, п-ов Таймыр, Краснояр. край Вода, р. Илыч Вода, р. Печора Почва, нефтепромысел Бытовая сточная вода, Китай Бытовая сточная вода, г. Харбин Вода, загрязненная нефтью Вода и донные отложения оз. Байкал Rhodococcus luteus ИЭГМ:
АС 35, АС 36, АС 37, АС 38, АС 39, АС 40, АС 171 Пласт. вода, нефт. месторождение, Пермская обл
АС 173, АС 175, АС 178 Вода, загрязненная нефтью, Камское водохранилище
АС 277 Кишечный тракт карпа
АС 278 Речная вода, Тюменская обл.
Rhodococcus erythropolis ИЭГМ:
АС 23, АС 22 Пласт. вода, нефт. месторождение, Пермская обл.
АС 179, АС 183, АС 184, АС 180 Вода, загрязненная нефтью, Камское водохранилище
АС 187, АС 189, АС 191, АС 192 Донные отложения, загрязненные нефтью, Тюменская обл.
АС 202, АС 203 Вода, родник нефтепромысла, Пермская обл.
АС 214 Бытовая сточная вода, г. Харбин
АС 257, АС 265 Вода, Пермская обл.
АС 555, АС 653, АС 564, АС 715 Природный водный источник
диметрическим методом [14] и использовали его для хроматографии на хитине.
Для выделения и очистки антибактериального фактора моллюсков предполагаемой мурамидаз-ной природы был использован метод специфической сорбции на хитине. В работе использовали стеклянную хроматографическую колонку 0.8 х х 10 см, которую заполняли хитиновым сорбентом, суспендированным в 0.1 М фосфатном буфере, рН 8.5. В предварительных экспериментах определяли ее сорбционную емкость. Для этого через хроматографическую колонку пропускали раствор яичного лизоцима ("Ферейн", Россия) с концентрацией 50 мкг/мл, собирали фракции объемом 5 мл и определяли в них литическую активность в отношении Micrococcus lysodeikticus (штамм № 2665 Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва). Сорбционная емкость используемой колонки составляла 0.8 мг лизоцима на 1 г сорбента.
Для того чтобы уменьшить сорбцию посторонних белков, проводили предварительную подготовку экстрактов, закисляя их 0.2 М раствором
уксусной кислоты до рН 4.0, выпавший осадок удаляли центрифугированием (9000 10 мин). Затем рН супернатанта доводили до 8.5 2 н. КаОН и выпавший осадок отделяли центрифугированием в том же режиме. Полученный прозрачный экстракт (20-30 мл) наносили на колонку, уравновешенную 0.1 М фосфатным буфером, рН 8.5. Для увеличения эффективности работы колонки экстракт наносили порциями по 10 мл и после нанесения каждой порции колонку промывали 30 мл уравновешивающего буфера. После окончательного нанесения всего объема экстракта колонку промывали тем же буфером до исчезновения в элюате белка (контроль при 280 нм) и дистиллированной водой для удаления солей. Лизоцим элюировали 0.2 М раствором уксусной кислоты путем резкого изменения рН среды [15].
Отбирали фракции, обладающие наибольшей бактериолитической активностью по отношению к М. lysodeikticus.
Концентрирование и очистку лизоцима осуществляли в концентраторах фирмы "Ашюоп" (США) 3 типов: СепИ1соп-30, СеШйсоп-Ю, Сеп-Мр1ш УМ-3. Концентрацию белка в экстрактах и элюатах определяли по методу Лоури [16].
Оценку гетерогенности полученного препарата лпзоцпма моллюска U. pictorum и ориентировочное определение молекулярной массы фермента проводили с использованием вертикального электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле с добавлением 0.1%-ного додецил сульфата натрия (ДДС-Na) по методу Лемли. В качестве метчиков использовали маркерные белки фирмы "Pharmacia" (Швеция), а также яичный лизоцим фирмы "Ферейн" (Россия). Для выявления антибактериальной активности фракций препарата непосредственно в геле проводили электрофорез с мочевиной в 5%-ной уксусной кислоте [17, 18], для чего гель после завершения электрофореза двукратно промывали в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4, в течение 15 мин и разрезали на две части. Одну половину окрашивали для выявления локализации белковых фракций, а вторую половину заливали 25 мл 0.8%-ной агарозы, в которую было внесено 20 мкл разведенной в 10 раз бульонной культуры M. lysodeikticus, штамм № 2665, с оптической плотностью по ФЭК (к = 540 нм), равной 0.115. Инкубировали в течение 36 ч. Появление зоны лизиса тест-культуры свидетельствовало о локализации в данном участке геля белковой фракции, обладающей литической активностью.
Литическую активность препарата определяли турбидиметрически с использованием суспензий живых и обработанных хлороформом [19] клеток M. lysodeikticus в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 540 нм. За единицу активности препарата принимали величину падение оптической плотности суспензии на 0.001 за 1 мин. Вычисляли бактериолитическую активность в 1 мл препарата (ед./мл) и в пересчете на количество белка (ед./мг белка), используя в качестве стандарта препарат лизоцима фирмы "Ферейн" (Россия) при концентрации белка 1 мкг/мл.
Культивирование алканотрофных родокок-ков. Исследуемые культуры предварительно выращивали при 28°C в течение 3-4 сут на МПА (г): пептон - 10.0, NaCl - 5.0, агар - 20.0, вода дистиллированная - 1000.0 мл, рН 7.2-7.4. Затем из этой бактериальной культуры готовили исходную бактериальную взвесь в физиологическом растворе плотностью в 10 единиц оптического стандарта ГНИИСКМБП им. Л.А. Тарасевича, которую использовали для посева на минеральную Киевскую среду [20], содержащую следующие компоненты (г/л): KNO3 - 1.0; KH2PO4 - 1.0; K2HPO4 -1.0; NaCl - 1.0; MgSO4 - 0.2; CaCl2 - 0.02; FeCl3 -0.001 и раствор микроэлементов по Пфеннигу из расчета 1.0 мл/л, а в качестве источника углерода в среду вносили ацетат аммония в количестве 2 г/л [21]. После 1-суточного культивирования при 28°C, полученную культуру разливали в 2 пробирки: в первую вносили 10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.